基因組學課件

第十三章基因組學第十三章基因工程和基因組學第一節(jié)基因組學概述基因組學(genomics)：

遺傳學研究進入分子水平后發(fā)展起來的一個分支，主要研究生物體內(nèi)基因組的分子特征。

*研究對象：以整個基因組為研究單位，而不以單個基因為單位作為研究對象。

*研究目標：認識基因組的結構、功能和進化；

闡明整個基因組所包含的遺傳信息和相互關系；

充分利用有效資源，預防和治療人類疾病。基因組(Genome)：又稱染色體組，是指一個物種單倍體的染色體數(shù)目，是生物體全部遺傳物質(zhì)的總和?；蚪M學(Genomics)：對生物體所有基因進行基因組作圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一門科學。最終目標：獲得生物體全部基因組序列，注解基因組所含的全部基因，鑒定所有基因的功能及基因間相互作用關系，并闡明基因組的復制及進化規(guī)律。一、基因組學的概念1.人類基因組計劃與曼哈頓原子計劃、阿波羅登月計劃并稱的人類科學史上的重大工程。于1990年首先在美國啟動，后有德、日、英、法、中等國的科學家先后正式加入。（一）人類基因組▲

1990年，美國國會批準美國的“人類基因組計劃”在10月1日正式啟動。其總體規(guī)劃是準備在15年內(nèi)（1990－2005）至少投入30億美元，分析人類的基因組30億個堿基對。

▲

2003年，6國科學家宣布人類基因組序列圖繪制成功，HGP的所有目標全部實現(xiàn)。覆蓋人類基因組所含基因區(qū)域的99%，精確率達到99.99%，比原計劃提前兩年多，耗資27億美元。人類基因組計劃人類基因組核基因組DNA的總長約3×109bp，含有24條線性DNA分子，最長的有250Mb，最短的55Mb。30億個堿基對。線粒體基因組是長度為16569bp的環(huán)狀DNA分子，每個細胞平均含有800個線粒體，每個線粒體含10個基因組拷貝。以每10cm書寫60個字母計算，30億個堿基對連接的長度可達5000km，相當于北京到香港來回的距離。我國超級雜交稻（秈稻）基因組計劃2001年7月啟動

2002年4月5日《Science》。

☆材料：秈稻“9311”。

☆完成單位：華大基因研究中心、中科院遺傳與發(fā)育生物學研究所等12個單位。

☆水平：水稻基因組的總基因數(shù)約為46022～55615個，工作框架圖序列已覆蓋水稻整個基因組92％以上的基因。

☆方法：“鳥槍射擊法”，利用國產(chǎn)曙光2000、曙光3000超級計算機(1000億次/秒)對隨機DNA碎片進行排序和組裝。水稻基因組計劃國際水稻（粳稻）基因組計劃始于1998年，日本、美國、中國、法國等國家和地區(qū)參加。中國負責第4號染色體：36Mb(占9~10%)。國際水稻基因組測序計劃2002年12月21日《Nature》，中國第四號染色體。

☆材料：粳稻“日本晴”。

☆完成單位：中科院國家基因研究中心等4家單位。

☆水平：第四號染色體中的總堿基數(shù)目為0.35億堿基對，覆蓋全長序列98％的區(qū)域，只剩下7個小空洞，堿基序列的精確度達到99.99%。完整測定的著絲粒序列在高等生物中屬于首次。國際水稻基因組測序計劃C值：是指一個單倍體基因組中DNA的總量。值悖理（Cvalueparadox）：物種的C值和它的進化復雜性之間無嚴格對應關系的現(xiàn)象稱為C值悖理，是復雜生物基因組的一個普遍特征（三）C值悖理和N值悖理（三）C值悖理和N值悖理N值：是指生物體所含有的基因數(shù)目。N值悖理（Nvalueparadox）：復雜性不同的生物種屬所具有的基因數(shù)目與其生物結構的復雜性不成比例的現(xiàn)象。如結構比較簡單的線蟲含有的基因數(shù)為1.9萬個,比線蟲更復雜的果蠅基因數(shù)為1.8萬個,水稻的基因數(shù)約4萬個,最復雜的人類其基因總數(shù)約3萬個。四、基因組學研究內(nèi)容（一）結構基因組學(structuralgenomics)通過基因作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、進行基因定位的科學。遺傳信息在染色體上,但染色體不能直接用來測序,必須將基因組這一巨大的研究對象進行分解,使之成為較易操作的小的結構區(qū)域,這個過程就是基因作圖。完成基因組圖譜構建之后，就可以利用圖譜進行基因組序列測定和組裝。四、基因組學研究內(nèi)容（三）蛋白質(zhì)組學(proteomics)研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律。旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式,內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)表達、存在方式、結構、功能和相互作用方式等?；蚴沁z傳信息的攜帶者,而全部生物功能的執(zhí)行者卻是蛋白質(zhì),僅僅從基因的角度來研究是遠遠不夠的。第2節(jié)基因組圖譜構建基因組計劃的目的是獲得全基因組序列，并對其進行解讀。DNA測序每次反應僅能讀取1000bp的長度，因此，基因組測序的基礎是基因組圖譜的構建。鳥槍射擊法(shotgun)基因組序列測定

第2節(jié)基因組圖譜構建基因組測序策略

☆重疊群法相互存在重疊序列的一組克隆。根據(jù)重疊群的相對位置講各個克隆首尾相連，長度可達百萬級bp。對單個重疊群，采用鳥槍法測序，然后進行組裝。這是由上而下（uptodown）的測序策略。

☆直接鳥槍法

首先進行全基因組鳥槍法測序，再用分子標記為起點強鳥槍DNA片段組裝。這是由下而上（bottomtoup）的測序策略。這種方法依賴于高密度分子標記基因組圖譜?；蚪M圖譜分為遺傳圖譜和物理圖譜。DNA標記☆以DNA為基礎的分子標記主要包括◆基于雜交的分子標記，如RFLP。◆基于PCR的分子標記，如RAPD、AFLP、SSR(又稱microsatellite)、AFLP等?！艋贒NA序列和芯片的分子標記，如SNP（singlenucleotidepolymorphism）。RAPD由Williams等（1990）和Welsh等（1990）分別發(fā)展起來的分子標記技術。這一技術是以基因組DNA為模板，采用隨機設計的單個寡核甘酸序列（一般為10bp）為引物，通過PCR擴增，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，用于檢測DNA序列的多態(tài)性。RAPD

（RandomamplifiedpolymorphicDNA）☆重復序列◆串聯(lián)重復序列（tandemrepeatedsequence），其重復單位首尾相連，成串排列（Flavell1986）。◆散布重復序列（interspersedrepeatedsequence），其重復單位與其它無關序列或單拷貝序列相間排列。SSR（simplesequencerepeats）或微衛(wèi)星（microsatellite)ISSR是一種新型的分子標記。與SSR相反，直接用同位素標記SSR序列，擴增2個SSR間的單拷貝序列。為了增加擴增的特異性，在引物的5′和3′端分別加入1～2個選擇性堿基，引物長度16～18bp。ISSR（inter-ssr）☆

AFLP結合了RFLP和RAPD技術的優(yōu)點。AFLP的基本原理是基于PCR的擴增基因組DNA限制性片段多態(tài)性?；蚪MDNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭（adapter）連接到DNA片段的末端，通過選擇在3′端分別添加1～3個選擇性堿基的不同引物，選擇性地識別具有特異配對順序的酶切片段并與之結合，從而實現(xiàn)特異擴增。AFLP

(Ampliconfragmentlengthpolymorphism)

☆從組織細胞中提取總mRNA，構建成標準cDNA文庫，然后從中挑取大量克隆，利用載體通用引物測出插入載體的cDNA片段5′端或3′端300-500堿基的序列。☆將測序所得的EST與dbEST等數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較分析,根據(jù)核酸或蛋白質(zhì)序列的同源性比較，可以鑒定出哪些EST代表已知基因，哪些EST代表未知基因。EST☆序列標簽位點（sequencetaggedsite）是一小段DNA序列。每個基因組僅1個拷貝，很容易分辨。STS要滿足2個條件：

◆是一段已知的序列，可據(jù)此涉及PCR引物來檢測不同DNA片斷中是否存在這一序列。

◆

STS在染色體上必須是獨一無二的。如果在基因組中有多個位點出現(xiàn)，作圖數(shù)據(jù)將含混不清?！畛Ｒ姷膶ふ襍TS的方法：

EST、SSLP、隨機基因組序列STS☆單核苷酸多態(tài)性是指基因組ＤＮＡ序列中由于單個核苷酸(Ａ,Ｔ,Ｃ,Ｇ)的替換而引起的多態(tài)性。通常SNPs不包括堿基的插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變化。這種標記只有兩種等位基因。人類基因組的編碼基因中有20萬個SNPs,在非編碼區(qū)的數(shù)目可能還要多10倍以上?！顔伪缎停寒斍俺Ｓ眯g語“happlotype”(單倍型)代替術語“allele”(等位基因)。在給定的一條染色體的緊密連鎖的位點上多個等位基因的集合,通常3～4個相鄰等位基因彼此靠近而構成的單倍型可作為一個整體而遺傳(稱為單倍型塊(haploblock)SNP(singlenucleotidepolymorphism)特性RFLPRAPDSSRISSRAFLP分布普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在遺傳共顯性多數(shù)顯性共顯性多數(shù)顯性多數(shù)顯性多態(tài)性中高高高非常高等位檢測是不是是不是不是檢測位點數(shù)1~31~101~50~50~更多20~100樣品信息量低~中高高高非常高基因組區(qū)域底拷貝編碼整個基因組整個基因組整個基因組整個基因組技術難度中等簡單簡單簡單中等重復性高中等高高高DNA樣品量2~30μg1~100ng50-100ng2~50ng100ng反射線一般是不是不是不是一般是耗費時間慢快快快中等可靠性高中等高高高（二）遺傳圖譜的構建1人類基因組遺傳圖譜的構建◆人類的遺傳圖譜是利用家系分析法，在對8個家系的134個成員的分析中(186個減數(shù)分裂)，主要根據(jù)5264個STR標記繪制而成的。◆利用這些家系的資料繪制第1至22號染色體圖譜。對于X染色體圖譜，還利用了來自另外12個家系，170個成員(105個減數(shù)分裂)的資料繪制而成?！糇詈螅瑢?264個標記定位在2335個位點（其中有些標記相距很近而作為一個位點）。2植物基因組遺傳圖譜的構建◆作圖群體常用的遺傳作圖群體有F2群體、回交群體、加倍單倍體（doublehaploid，DH）群體、重組近交系（recombinantinbredlines，RIL）群體、近等基因系（near—isogeniclines，NIL）群體等（徐云碧，1994）?！暨z傳標記的染色體定位◆標記間的連鎖分析

LINKAGE、Mapmaker、JoinMap二、物理圖譜繪制（一）限制性作圖（二）基于克隆的基因組作圖（三）原位雜交（四）序列標簽位點（STS）作圖（五）人類基因組圖譜重疊群（contigousDNAclones,contigs）◆從1個感興趣的位置開始，利用第1個元件的末端部分來辯別第2個元件，沿染色體“行走”（walk）。通過鑒別目標位點兩測的2個DNA標記，從1個標記向另1個標記的行走?！粞厝旧w鑒別一系列重疊群是大規(guī)模研究的基礎。在特定區(qū)域的染色體行走可以提供分離通過遺傳圖譜定位在該區(qū)域基因的方法。集中全部染色體的重疊群，可以為以后研究提供有效克隆來源?！羧旧w行走考慮的根本是每“步”的大小，較大的步加快積聚相鄰克隆的進程。（二）基于克隆的基因組作圖區(qū)域作圖Regionalmapping區(qū)域作圖RegionalmappingMinimaltilingpathselectedforsequencing.區(qū)域作圖Regionalmapping（三）原位雜交☆熒光原位雜交（fluorescentinsituhybridization,FISH）☆基因組原位雜交（genomeinsituhybridization,GISH

）（四）序列標簽位點（STS）作圖☆輻射雜交系是含有另一種生物染色體片斷的嚙齒類細胞。帶有人類染色體片段的輻射雜交系☆

DNA庫

YAC/BAC☆克隆作圖獲得大分子DNA克隆文庫以后，用PCR的方法檢測STS，根據(jù)重疊的STS標記繪制克隆連鎖圖。（四）序列標簽位點（STS）作圖當兩個片段含有同一STS順序時，則這兩個片段彼此重疊。如果它們彼此鄰接，這兩個STS總會同時出現(xiàn)在相同片段上。如果它們相距甚遠，有時會在同一片段，有時則在不同片段。要將一組STS作圖定位，必需收集來自同一染色體或整個基因組隨機斷裂的DNA片段。不同DNA片段之間有各種可能的重疊，可以覆蓋整個作圖區(qū)段。依次采用單個STS挑出它們所在的DNA片段，根據(jù)它們彼此的重疊關系可以逐段繪DNA物理圖。☆生物信息學是現(xiàn)代生物技術與計算機科學的結合，收集、加工和分析生物資料和信息的學科?！顟蒙镄畔W可以將來自不同的基因組理論和應用綜合并標準化，利用大量的生物信息資料了解遺傳網(wǎng)絡系統(tǒng)、信號傳遞及相互關系，計算機還可進行一些生物模擬研究?！罾蒙镄畔W能夠分析從微生物、動物、植物以及人類基因組序列測定產(chǎn)生的大量資料，闡明遺傳信息。

研究內(nèi)容兩大類：DNA數(shù)據(jù)分析；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析。第三節(jié)生物信息學(bioinformatics)基因芯片基因芯片(genechip),又稱DNA微陣列(microarray),是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列,其基本原理是通過雜交檢測信息。利用基因芯片,可以實現(xiàn)基因信息的大規(guī)模檢測。生物信息學的應用（一）發(fā)現(xiàn)新基因和新的單核苷酸多態(tài)性在研究生物的基因時,不斷的發(fā)現(xiàn)新的基因。一般說來,從基因組DNA預測新基因,是發(fā)現(xiàn)新基因的另一個重要途徑。SNP出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的編碼基因上,它可改變