細(xì)胞凋亡課件

概述細(xì)胞凋亡過程與機(jī)制細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞凋亡的檢測

第八章細(xì)胞凋亡第八章細(xì)胞凋亡悉尼·布雷諾爾羅伯特·霍維茨約翰·蘇爾斯頓2002年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎獲得者

概述第八章細(xì)胞凋亡

一、細(xì)胞死亡的模式■Necrosis=細(xì)胞病理性死亡■

Apoptosis=細(xì)胞自發(fā)性死亡壞死凋亡第八章細(xì)胞凋亡apoptosis第八章細(xì)胞凋亡Conceptofapoptosis:

體內(nèi)外生理或病理因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)死亡程序→細(xì)胞死亡第八章細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡的區(qū)別第八章細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別特征細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強(qiáng)烈刺激受累范圍單個細(xì)胞丟失成群細(xì)胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細(xì)胞體積減小、固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞器無明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細(xì)胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機(jī)降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無后果不引起炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)意義生理死亡方式病理死亡方式第八章細(xì)胞凋亡凋亡的生理學(xué)意義:■胚胎發(fā)育期去除某些細(xì)胞■維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定

增殖細(xì)胞群中細(xì)胞去除、去除潛在有害的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞■參與防御反應(yīng)細(xì)胞毒T細(xì)胞

凋亡過多或不足→→疾?。耗[瘤、艾滋病、神經(jīng)變性性疾病、缺血性損傷第八章細(xì)胞凋亡

二、凋亡時細(xì)胞的主要變化

1.形態(tài)學(xué)改變

（Themorphologiccharacteristicsofapoptosis）

凋亡細(xì)胞（實體細(xì)胞）與周圍細(xì)胞脫接觸

胞膜空泡化（Blebbing）

細(xì)胞固縮（Condensation）、核固縮和發(fā)芽

凋亡小體（Apoptoticsmallbody）第八章細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡第八章細(xì)胞凋亡(掃描電鏡)正常細(xì)胞(掃描電鏡)(透射電鏡)

凋亡細(xì)胞—凋亡小體第八章細(xì)胞凋亡DNA片斷化caspase激活滅活凋亡抑制物水解活性蛋白水解結(jié)構(gòu)蛋白Ca2+/Mg2+

Zn2+核酸內(nèi)切酶激活①②③2.生化改變（Thebiochemicalcharacteristicsofapoptosis）鈣超載第八章細(xì)胞凋亡■DNA片段化（DNAladdingpattern）

核酸內(nèi)切酶激活

核小體連接區(qū)DNA降解180～200bp整數(shù)倍的DNA片段第八章細(xì)胞凋亡

■細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻第八章細(xì)胞凋亡凋亡的過程及機(jī)制凋亡誘導(dǎo)因素死亡信號凋亡相關(guān)基因激活

Caspases激活、DNase激活凋亡的執(zhí)行

巨噬細(xì)胞吞噬分解凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞清除

第八章細(xì)胞凋亡凋亡的機(jī)制第八章細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的兩條通路：死亡受體途徑、線粒體途徑第八章細(xì)胞凋亡（1）死亡受體途徑

（deathreceptorpathway）死亡受體（deathreceptor,DR）腫瘤壞死因子受體超家族成員，跨膜蛋白，與相應(yīng)配體結(jié)合傳遞細(xì)胞信號

Fas(CD95),TNFR1,RAIL-R2/DR5第八章細(xì)胞凋亡

參與死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白：

死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（

deathdomainprotein,DD）TRADD：TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

TNF+TNFR1（死亡結(jié)構(gòu)域）+TRADD→→細(xì)胞凋亡FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

FasL+Fas（死亡結(jié)構(gòu)域）

+FADD→→細(xì)胞凋亡

第八章細(xì)胞凋亡FasL+Fas凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物（DISC）

FADD（C端DD結(jié)構(gòu)域與Fas胞內(nèi)段結(jié)合

N端DED結(jié)構(gòu)域與無活性caspase8酶原交聯(lián)）

caspase8酶原聚集到復(fù)合物上一系列caspase激活細(xì)胞凋亡

第八章細(xì)胞凋亡FADD（Fas-associateddeathdomain）DD（deathdomain）DED（deatheffectordomain）FSALFADDPro-caspase-8Caspase-8Caspase-3Pro-caspase-3細(xì)胞凋亡FasDEDDEDDD第八章細(xì)胞凋亡第八章細(xì)胞凋亡（2）線粒體途徑線粒體釋放細(xì)胞色素C→→細(xì)胞凋亡

PT孔開放→線粒體跨膜電位↓，細(xì)胞色素C釋放促凋亡蛋白Bax促PT孔開放抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl抑制PT孔開放第八章細(xì)胞凋亡細(xì)胞色素C+Apaf-1+caspase9前體—凋亡體

召集并激活caspase3→→細(xì)胞凋亡

Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子第八章細(xì)胞凋亡膜通透性↑、線粒體腫脹、△m↓Apaf-1活化Cyt.c

線粒體途徑（mitochondrialpathway）

Ca2+NO缺氧活性氧應(yīng)激PT開放Cyt.c+Pro-caspase-9Caspase-9ATPApaf-1+Apaf-1活化Cyt.cCARDApoptosomeAIFcaspase-independentapoptosisPro-Caspase-3凋亡Caspase-3BidCaspase-8第八章細(xì)胞凋亡

Caspase依賴的細(xì)胞凋亡

（Caspase-dependentapoptosis）Caspase特點：

--以酶原的形式存在

--酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性

--水解天冬氨酸C端肽鍵故稱Caspases(Cysteine，asparticacid，protease)

第八章細(xì)胞凋亡Caspase家族的分類凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶：

Caspase8，Caspase9，Caspase10凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶：

Caspase3，Caspase6，Caspase7ICE(interlukin-1βconvertingenzyme)亞類Caspase蛋白酶：參與炎癥反應(yīng)

Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11,Caspase12，Caspase13，Caspase14第八章細(xì)胞凋亡■Caspase通路分類

啟動亞類（Caspase-8,-9,-10）效應(yīng)亞類（Caspase-3,-6,-7）▲

Caspase死亡受體途徑線粒體途徑大小亞基結(jié)合（二聚體）

caspase激活（四聚體）■

Caspase激活形式

Pro-caspase：NH2末端結(jié)構(gòu)域、20KD亞基、10KD亞基剪切第八章細(xì)胞凋亡第八章細(xì)胞凋亡Caspase可激活CAD(caspase-activatedDNase)核酸酶，該酶在核小體的連接區(qū)將DNA切斷，形成約200bp整倍數(shù)的核酸片段正常情況下，CAD與抑制物ICAD-DFF-45結(jié)合，存在于胞質(zhì)中，無活性Caspase活化后降解抑制物ICAD，CAD激活并入核降解DNA使其片段化第八章細(xì)胞凋亡Pro-caspase-2caspase-2Pro-caspase-6Caspase-6Pro-caspase-7caspase-7Pro-caspase-9ICAD（抑制性CAD）CAD（caspase活化DNA酶）CDA進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)降解DNA細(xì)胞凋亡剪切細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白caspase-9EffectorcaspaseCaspase-3Pro-caspase-3第八章細(xì)胞凋亡Caspase的作用第八章細(xì)胞凋亡

Caspase非依賴的細(xì)胞凋亡（Caspase-independentapoptosis）

■凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）線粒體蛋白AIF釋放到胞質(zhì)內(nèi)與抑制凋亡的因子結(jié)合，從而促發(fā)凋亡

■鈣超載第八章細(xì)胞凋亡鈣超載引起凋亡機(jī)制胞漿[Ca2+]↑■激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄■激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈■激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，使細(xì)胞骨架分解→凋亡小體細(xì)胞凋亡第八章細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的調(diào)控凋亡相關(guān)因素凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡相關(guān)基因第八章細(xì)胞凋亡

（Themainlyinducedfactorsofapoptosis）

Table：Influencefactorsofapoptosis

誘導(dǎo)性因素（Inducers）抑制性因素（Inhibitors）理化因素射線、高溫、強(qiáng)酸、細(xì)胞因子IL-2、NGF等強(qiáng)堿、應(yīng)激、抗癌藥激素ACTH、睪丸酮、雌激素激素和因子糖皮質(zhì)激素、TNF其它Zn2+、苯巴比妥、半胱氨免疫性因素CTL分泌的粒酶酸蛋白酶抑制劑、EBV、病原體因素HIV、HCV牛痘、病毒、中性氨基酸

1、影響細(xì)胞凋亡的因素第八章細(xì)胞凋亡2、凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點①多樣性：不同種類細(xì)胞有不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)②偶聯(lián)性：死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與細(xì)胞增殖、分化過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在一些環(huán)節(jié)上交叉、偶聯(lián)③同一性：不同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)引起細(xì)胞凋亡④多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可經(jīng)過多條信號途徑觸發(fā)細(xì)胞凋亡第八章細(xì)胞凋亡3、細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因

（Regulatedmechanismofapoptosis）表1細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因

功能基因抑制凋亡基因Bcl-2Bcl-XL、A1/Bfl-1、Bcl-w、Bcl-G和Mcl-1等促凋亡基因P53、Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Bik、Bok、

Bcl-B、Bcl-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa等雙向調(diào)控基因c-myc、Belx第八章細(xì)胞凋亡

Bcl-2基因（Bcelllymphoma/leukemia-2）廣泛存在于造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及多種瘤細(xì)胞

Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個成員，可分為3個亞族：

Bcl-2亞家族：抑制細(xì)胞凋亡

Bax亞家族：促進(jìn)細(xì)胞凋亡

BH3亞家族：促進(jìn)細(xì)胞凋亡第八章細(xì)胞凋亡第八章細(xì)胞凋亡Bcl-2抑制凋亡機(jī)制：■

抑制線粒體PT孔開放，Cyt.c、AIF釋放↓■結(jié)合和滅活A(yù)paf-1，阻斷caspase-9活化■特異性結(jié)合細(xì)胞色素C■維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)第八章細(xì)胞凋亡c-myc,bcl-x

促進(jìn)增殖c-myc(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)

誘導(dǎo)凋亡

Bcl-XL→抑制凋亡Bcl-xBcl-Xs→促進(jìn)凋亡GF第八章細(xì)胞凋亡p53促凋亡機(jī)制：

--

與Bcl-2基因相互作用，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)

--誘導(dǎo)線粒體內(nèi)凋亡的相關(guān)蛋白（Bax等）表達(dá)，并觸發(fā)細(xì)胞色素C釋放和caspase活化

--誘導(dǎo)死亡受體Fas表達(dá)

第八章細(xì)胞凋亡C-myc雙向調(diào)控凋亡

調(diào)控細(xì)胞周期基因，編碼的蛋白是DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。

GF充足時主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因

GF不足時激活凋亡基因

第八章細(xì)胞凋亡

凋亡與疾?。―iseasesassociatedtoapoptosis）

表：與細(xì)胞凋亡異常相關(guān)的疾病

凋亡不足凋亡過度腫瘤肝癌、惡性血液腫瘤、乳腺癌發(fā)育異常氣管-食管瘺、房（室）間隙缺、膀胱癌、肺癌、膠質(zhì)瘤、前損、唇（腭）裂、短肢畸形、列腺癌等尿道下裂以及多囊腎等發(fā)育異常先天性消化道、膽道、肛門狹CNSAlzheimer病、Parkinson病、窄或閉鎖、動脈導(dǎo)管未閉、兩肌萎縮性側(cè)索硬化癥、色素性性畸形、甲狀舌骨囊腫等視網(wǎng)膜病，脊肌肉萎縮、早老免疫系統(tǒng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、類性癡呆風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、橋本甲狀腺炎免疫系統(tǒng)免疫缺陷病、AIDS

、多發(fā)性的硬化癥等第八章細(xì)胞凋亡（一）細(xì)胞凋亡不足（Apoptosisinhibition）1.腫瘤（Tumor）■

bcl-2基因過表達(dá)85%濾泡狀和20%彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤

染色體t（14;18）易位

IgH基因與bcl-2基因拼接

bcl-2基因活化細(xì)胞凋亡速率↓腫瘤發(fā)生

（乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等也存在Bcl-2高表達(dá)）第八章細(xì)胞凋亡■p53基因缺失或突變

p53的穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)定位或（和）活性異常

p53表達(dá)或功能缺陷細(xì)胞凋亡率↓腫瘤發(fā)生

■病毒的癌基因HBV編碼的HBX是Caspase-3的強(qiáng)效抑制物，與肝癌發(fā)生密切相關(guān)第八章細(xì)胞凋亡■異常融合蛋白慢性髓細(xì)胞性白血?。–ML）染色體易位t(9；22)Bcr-abl融合基因（p210Bcr-abl蛋白質(zhì)）

NF-B活化、細(xì)胞凋亡速率↓髓系祖細(xì)胞的克隆擴(kuò)增腫瘤發(fā)生第八章細(xì)胞凋亡2．自身免疫?。ˋutoimmunediseases）針對自身抗原的免疫細(xì)胞未被及時清除，機(jī)體產(chǎn)生針對自身抗原的體液免疫和細(xì)胞免疫，導(dǎo)致器官組織損傷。第八章細(xì)胞凋亡（二）細(xì)胞凋亡過度（Apoptosisexcess）1.心肌缺血與缺血-再灌注損傷■特點▲缺血早期以凋亡為主，晚期以細(xì)胞壞死為主?！诠Ｋ涝畹闹行囊詨乃罏橹?，梗死灶周邊以凋亡為主；▲輕度缺血以凋亡為主，重度缺血以壞死為主；■機(jī)制▲氧化應(yīng)激▲Fas通路▲p53基因轉(zhuǎn)錄增加第八章細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡在疾病防治中的意義㈠合理利用凋亡相關(guān)因素1.誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡

放療、化療

高熱、高溫2.減少細(xì)胞凋亡：

NGF、促生長因子、抗氧化劑抑制Bcl-2抗凋亡作用促進(jìn)促凋亡基因作用增強(qiáng)P53促凋亡作用第八章細(xì)胞凋亡㈡干預(yù)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)㈢調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因㈣控制凋亡相關(guān)酶學(xué)機(jī)制㈤防止線粒體跨膜電位的下降第八章細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡的檢測1、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測

2、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）

3、線粒體膜勢能（mt）的檢測

4、DNA片斷化檢測

5、TUNEL法

6、Caspase-3活性的檢測

7、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

第八章細(xì)胞凋亡1、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測

光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞V變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期可見凋亡小體。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。

電子顯微鏡觀察第八章細(xì)胞凋亡NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm400）第八章細(xì)胞凋亡電鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多空泡結(jié)構(gòu)。IIa染色質(zhì)高度凝集、邊緣化。凋亡晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡