基因組的印記機(jī)制與胚胎發(fā)育的關(guān)系

基因組的印記機(jī)制與胚胎發(fā)育的關(guān)系基因組印記(GenomicImprinting)使一個(gè)基因的兩個(gè)親本拷貝只有一個(gè)被表達(dá)，是一種不遵循孟德爾遺傳規(guī)律的親本等位基因差異表達(dá)現(xiàn)象,即DNA甲基化修飾通過(guò)啟動(dòng)子附近的差異甲基化區(qū)域控制等位基因的不對(duì)稱表達(dá)，不對(duì)稱表達(dá)的基因稱為印記基因。配子發(fā)生和早期胚胎形成過(guò)程中，基因組印記經(jīng)歷了擦除和重建，并在此后的生命過(guò)程中維持印記，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)錯(cuò)誤都可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育缺陷，甚至死亡。1.基因印記的主要執(zhí)行者一一DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因印記的建立和維持依賴于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAMethylationTransferase，DNMT)的參與，DNMT的缺失或功能異常導(dǎo)致的印記異常會(huì)嚴(yán)重阻礙正常的胚胎發(fā)育。哺乳動(dòng)物的DNMT家族主要成員有：Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L等。Dnmtl、Dnmt3a和Dnmt3b能夠催化甲基到CpG二核苷酸的胞嘧啶5位上；Dnmt3L不具有催化活性，但可協(xié)同Dnmt3a和Dnmt3b發(fā)揮功能，也是印記建立的必需因子。DNMT家族的各個(gè)成員在不同的發(fā)育階段有不同的表達(dá)譜，分別在甲基化的維持和建立過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Dnmtl是哺乳動(dòng)物最主要的甲基轉(zhuǎn)移酶，表達(dá)于復(fù)制狀態(tài)的增殖細(xì)胞，能夠優(yōu)先催化復(fù)制后半甲基化的DNA雙鏈，使低甲基化的子鏈完全甲基化，在甲基化的維持中具有重要作用。因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中第一個(gè)內(nèi)含子的選擇性不同，Dnmtl的轉(zhuǎn)錄物有3種亞型,Dnmtls、Dnmtlo、Dnmtlp。Dnmtlo表達(dá)于卵母細(xì)胞和植入前的胚胎細(xì)胞，直至胚泡期被其他亞型所取代。研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)Dnmtlo的表達(dá)對(duì)胚胎印記的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于卵母細(xì)胞印記。母鼠卵母細(xì)胞Dnmtlo的啟動(dòng)子和第一個(gè)外顯子敲除后，卵母細(xì)胞印記不受影響，后代于妊娠晚期死亡。死亡胚胎的基因印記出現(xiàn)錯(cuò)誤，Hl9、Snrpn呈異常雙等位基因表達(dá)。同樣，胚胎死亡也可以來(lái)自于Dnmtl基因過(guò)度表達(dá)引起的基因組DNA超甲基化和印記丟失。最近有學(xué)者以基因芯片大范圍研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的小鼠胚胎與自然狀態(tài)沒(méi)有明顯的基因表達(dá)差別，但其中Dnmtl的表達(dá)有增加現(xiàn)象，其原因和對(duì)胚胎發(fā)育可能的遠(yuǎn)期影響還有待進(jìn)一步研究。Dnmt3a、Dnmt3b作用于未甲基化的DNA雙鏈，兩者在催化功能上相互補(bǔ)充，Dnmt3a優(yōu)先使核小體之外裸露部分的DNA甲基化，而Dnmt3b使核心區(qū)甲基化。胚胎發(fā)育過(guò)程中兩者的表達(dá)部位也有所不同，Dnmt3a在胚胎外胚層中度表達(dá)、中胚層弱表達(dá)(7.5d胚胎)，而Dnmt3b高表達(dá)于胚胎的外胚層、神經(jīng)外胚層和滋養(yǎng)層。Dnmt3a-/-小鼠出生時(shí)無(wú)明顯異常，之后發(fā)育遲緩、體型矮小，于4周齡死亡。Dnmt3b-/-小鼠宮內(nèi)死亡，伴有多種孕晚期發(fā)育缺陷。Dnmt3a、Dnmt3b同時(shí)缺失的胚胎沒(méi)有體節(jié)，發(fā)育和表型停滯于原腸胚后期。Dnmt3L(DNAMethyltransferase3-likeProtein)在PHD鋅指區(qū)域與Dnmt3a和Dnmt3b有同源性，但缺乏高度保守的轉(zhuǎn)移酶基序，因此沒(méi)有催化活性，但Dnmt3L可以直接刺激Dnmt3a和Dnmt3b的DNA甲基化活性而發(fā)揮功能。三者共同參與卵母細(xì)胞基因印記的建立、正常精子的發(fā)生、胚胎和胎盤生長(zhǎng)發(fā)育。Dnmt3L缺陷的雌鼠雖然能產(chǎn)生成熟且有功能的卵子，但是其后代出現(xiàn)心包積液、露腦畸形和其他神經(jīng)管畸形、絨毛尿囊融合缺陷，于妊娠中期死亡。Dnmt3L缺失的雄鼠不能生育，精子發(fā)生停滯在精原細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的時(shí)期，曲精小管有極少量成熟精子。另外,Dnmt3L的缺失也會(huì)引起胎盤的發(fā)育異常。Dnmt3Lmat-/-小鼠的胎盤迷路層、膠質(zhì)細(xì)胞層缺陷，滋養(yǎng)層巨細(xì)胞增生，絨毛膜層和外胎盤錐之間連接減少。2.印記重組與胚胎發(fā)育印記的重組包括印記的擦除與重建，主要發(fā)生在配子的遷移和成熟過(guò)程中?；蚪M印記的完整性是原始生殖細(xì)胞(PrimordialGermCell，PGC)細(xì)胞核具有全能性的重要前提，同時(shí)也是配子成熟過(guò)程的必需步驟。2.1印記的擦除印記的擦除發(fā)生于PGC向生殖嵴遷移的過(guò)程中，而且在生殖細(xì)胞的分化過(guò)程中起到重要作用。小鼠的PGC從胚外中胚層向生殖嵴遷移，增殖發(fā)生在胚胎發(fā)育的10.5-13.5d。11.5d胚胎的PGC基因組具有與體細(xì)胞相同的高甲基化狀態(tài)，而13.5d胚胎的PGC甲基化已處于非常低的狀態(tài)°Peg3、Lit1、Snrpn(DMR1)、H19等基因印記的擦除多在1d(11.5-12.5d)內(nèi)完成，且無(wú)性別差異，以確保在配子印記建立之前具有相同的表觀遺傳狀態(tài)?；蛴∮浀耐暾耘c胚胎發(fā)育的關(guān)系在PGC的體細(xì)胞克隆試驗(yàn)中得到充分體現(xiàn)。Lee等將不同時(shí)期的PGC進(jìn)行體細(xì)胞克隆發(fā)現(xiàn)，12.5?13.5d胚胎的PGC克隆所得胚胎生長(zhǎng)遲緩，并于9.5d前后死亡，胚胎表型無(wú)性別差異，兩性PGC都存在相同的基因組印記缺陷，印記基因的差異表達(dá)完全消失，呈雙表達(dá)或沉默狀態(tài)。11.5d胚胎的PGC克隆胚胎發(fā)育狀況明顯好于上述胚胎，發(fā)育時(shí)間可維持11.5d，胚胎基因組印記狀態(tài)介于正常體細(xì)胞和完全擦除之間。隨后，更大范圍的PGC克隆試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，11.5-19.5d胚胎PGC克隆所得胚胎的大多數(shù)基因印記已被擦除，不能夠支持胚胎的正常發(fā)育；而8.5-9.5dPGC具有很好的基因印記完整性，移植入去核卵母細(xì)胞后能夠支持胚胎的完整發(fā)育。這一試驗(yàn)不僅反映了印記基因的擦除時(shí)間，而且證實(shí)了基因印記在胚胎全能發(fā)育中的意義。不同性別的生殖系，對(duì)下一代擦除由上一代傳遞的印記建立新的印記，有關(guān)鍵作用。已設(shè)想2個(gè)模型來(lái)描述這是如何發(fā)生的。首先，相同性別染色體基因型外印記保持，而相反性別的印記則被取消。這可能是一個(gè)單步機(jī)制。其次,先清除2個(gè)生殖細(xì)胞系的親本染色體中已有的非遺傳修飾，然后在稍后的階段中，以一種性別特異方式建立新的印記。在過(guò)去幾年對(duì)生殖細(xì)胞系的甲基化、表達(dá)和功能的研究中，已經(jīng)獲得相當(dāng)多的啟示。這些研究使平衡開始傾向于第二種模型。生殖細(xì)胞從外胚層的4-5細(xì)胞基礎(chǔ)群體中發(fā)育,并在鼠胚胎發(fā)育的7.5d時(shí)確定。原始生殖細(xì)胞（PGCs）在E10.5?E11.5時(shí)，通過(guò)胚外區(qū)和后腸遷移到它們的最終目的地一一生殖嵴中的生殖原基。在E13.5,雌性生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂前期，而雄性生殖細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂停滯。在出生以后，精原細(xì)胞恢復(fù)有絲分裂，然后是減數(shù)分裂。卵母細(xì)胞在出生后，排卵與受精之前，經(jīng)歷一段時(shí)間的生長(zhǎng)。在生殖細(xì)胞發(fā)育早期發(fā)生的整體甲基化也包括印記基因。所以，Igf2r、P57kip2、peg1、peg3、Snrpn、U2afrsl和Nnat都在E12.5時(shí)去甲基化。與雌性PGCs相比，雄性的H19和Igf2并不完全去甲基，而且有稍高水平的甲基化存在。這是基于PGCs的直接測(cè)試或使用胚胎生殖（EG）細(xì)胞系推斷出的。研究發(fā)現(xiàn)E8.5EG細(xì)胞的Igf2r區(qū)的母體甲基化仍存在于一些細(xì)胞系中，表明去甲基化發(fā)生于E8.5?E12.5。除此而外，對(duì)E12.5以前的各時(shí)期知之甚少［5］。這個(gè)時(shí)間部分被動(dòng)物功能性研究所支持。雖然用E8.5EG細(xì)胞所構(gòu)造的嵌合體發(fā)育正常,但用E12.5的EG細(xì)胞（來(lái)自2個(gè)性別）所構(gòu)造的嵌合體顯示胎兒生長(zhǎng)，致死性和骨骼畸形增強(qiáng)（這些表現(xiàn)型的一部分具有雄核發(fā)育嵌合體特征）［5］。在這些嵌合體中，正常母體甲基化基因中觀察到次甲基化，而且Igf2r被抑制（與預(yù)期的父系基因雙等位基因表達(dá)一起，可能對(duì)類雄核發(fā)育表型有貢獻(xiàn)）。H19和Igf2r似乎在嵌合體中50%甲基化，表明這些印記在產(chǎn)生EG細(xì)胞時(shí)的E12.5時(shí)仍保持。還不清楚任一時(shí)期中的雄性生殖細(xì)胞中H19的父本拷貝是否去甲基化（擦除印記）。不過(guò)，Igf2、H19、Igf2r和Snrpn從E11.5起都在2個(gè)種系中雙等位基因表達(dá)［6］，表明印記確實(shí)在這些時(shí)期中大部分被清除（或未識(shí)別）。融合試驗(yàn)表明，在胸腺淋巴細(xì)胞之間的EG細(xì)胞有一顯著的甲基化活動(dòng)作用于印記的以及非印記的基因和重復(fù)序列上。迄今檢測(cè)到的在早期生殖細(xì)胞中逃脫這種整體甲基化的唯一序列，似乎是Xist的5口區(qū)，此區(qū)在2個(gè)性別中都保持甲基化狀態(tài)，而且雄性生殖細(xì)胞中H19的父系拷貝也如前所及的保持著。對(duì)于雌性，印記基因甲基化形成的時(shí)間是相當(dāng)清楚的，但對(duì)雄性生殖細(xì)胞不太清楚。在雌性，甲基化發(fā)生于卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期間，處于dictyate抑制階段的卵母細(xì)胞直到出生后，顯然仍未甲基化。對(duì)于重復(fù)序列，Igf2r、印記轉(zhuǎn)基因已形成,而且由功能性研究也推測(cè)出Peg1、Peg2、Snrpn已形成。這些甲基化現(xiàn)象與生長(zhǎng)中的卵母細(xì)胞檢驗(yàn)中高水平DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmtl）的存在相一致。卵母細(xì)胞中仍未甲基化的其他印記基因（例如H19）是否在這一時(shí)期特異地防止重甲基化,還不得而知。這種保護(hù)也許是必要的。這可以從下列事實(shí)中得到證實(shí)即正常情況下父系甲基化，而且在EG細(xì)胞中去甲基化的P57kip2基因，在EG細(xì)胞嵌合體中重新甲基化。正如前面指出的，雄性生殖細(xì)胞中印記基因甲基化的形式，不易清楚地確定。不過(guò),H19和Igf2顯然是在出生前后形成的。這再次與精原細(xì)胞核中高水平的Dnmfl蛋白相一致。H19的祖代拷貝是否在這種重新甲基化發(fā)生之前完全去甲基化還不清楚。已經(jīng)提出，對(duì)雄性生殖細(xì)胞內(nèi)的重新甲基化是靶特異的，而不保護(hù)雌性生殖細(xì)胞中的重新甲基化。在假定的清除階段以及形成印記之前,2組功能性研究已經(jīng)用核移植方法檢驗(yàn)了生殖細(xì)胞，用源于未生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞的第二母體基因組，已制備雌核遺傳胚胎。當(dāng)這些胚胎與雌核遺傳胚胎相比時(shí)，表現(xiàn)了發(fā)育改進(jìn)，而且表達(dá)（假定未甲基化的）Peg1、Peg3和Snrpn基因。相比之下，Igf2r和P57kip2在來(lái)自未成熟的卵母細(xì)胞基因組中被抑制，再次表明它們的激活需要甲基化。移植E15.5至E16.5的雄性生殖細(xì)胞，而且獲得嵌合體，其中移植的核參與了胚胎和胚外發(fā)育至E10.5。由于未期望雄核遺傳細(xì)胞對(duì)嵌合體胚胎發(fā)育有貢獻(xiàn)（它們對(duì)胚外組織有貢獻(xiàn)）,所以這也許表明這些生殖細(xì)胞仍處于獲得父系印記之前的某一階段。2.2印記的重建基因組印記的建立是生殖細(xì)胞成熟過(guò)程中的重要事件，而且這一時(shí)間段是印記建立的特異時(shí)間窗，即印記基因甲基化的獲得只特異性發(fā)生于配子形成過(guò)程。印記的主要重新編程發(fā)生于發(fā)育中的胚胎生殖細(xì)胞系中。2種性別性細(xì)胞都經(jīng)歷整體去甲基化，包括印記的和非印記的基因。這個(gè)去甲基化集團(tuán)大概發(fā)生于E8.5?E12.5。嵌合體或核移植的這一階段生殖細(xì)胞功能研究表明，這種去甲基化確實(shí)與印記基因的實(shí)質(zhì)重新編程有關(guān)。還不清楚所有印記基因是否經(jīng)歷完全的重新編程。新的甲基化印記在出生后卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期間的雌性生殖細(xì)胞中完成，雄性則大概于出生前后完成。除了生殖細(xì)胞系特異新生甲基化外，可能還需要甲基化的防護(hù)。雌、雄兩性的配子分化、發(fā)育過(guò)程存在顯著差異，印記的建立在雌、雄兩性之間也存在顯著的差異。2.2.1雌性配子的印記重建在雌性生殖細(xì)胞的成熟過(guò)程中，擦除的基因組印記又逐步重新建立起來(lái)。在幼鼠和成年鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞基因組印記的建立與卵母細(xì)胞的直徑有關(guān)，與年齡無(wú)關(guān)。卵母細(xì)胞基因印記的建立大約起始于直徑達(dá)到40□m時(shí)，到達(dá)65□m時(shí)甲基化基本完成。卵母細(xì)胞基因組印記建立的過(guò)程是大量差異甲基化區(qū)域廣泛而有序的甲基化過(guò)程，這一過(guò)程存在基因特異性，不同的印記基因具有其建立的特異時(shí)間窗。在探索印記建立與胚胎發(fā)育關(guān)系的試驗(yàn)中，研究者將不同生長(zhǎng)階段的卵母細(xì)胞核移植入去核成熟卵母細(xì)胞，經(jīng)IVF2ET觀察胚胎的發(fā)育情況，結(jié)果只有大于60-69m的幼鼠卵母細(xì)胞和大于50~59um的成年小鼠卵母細(xì)胞能夠支持胚胎的完整發(fā)育。這與印記基因的建立時(shí)間基本吻合，也進(jìn)一步證明配子成熟過(guò)程中的印記建立對(duì)植入后的胚胎發(fā)育有重要意義。2.2雄性配子的印記重建雄性生殖細(xì)胞基因組印記的建立早于雌性，而且印記完成的過(guò)程比較漫長(zhǎng),主要發(fā)生在減數(shù)分裂之前的精原細(xì)胞階段。在小鼠二倍體精原細(xì)胞的印記建立過(guò)程中，父系等位基因與母系等位基因明顯不同步,H19的父系等位基因印記建立約需2d（14.5~15.5d胚胎）,母系等位基