基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟

基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟1材料（試劑和耗材）1.1樣本（小鼠組織）-2個(gè)引物（lifetechnology公司合成）BestarTMjPCRRTKit（德國DBI貨號(hào)：DBI-2220）Bestar?SybrGreenqPCRmastermix（德國DBI貨號(hào)：DBI-2043）96孔板（美國lifetechnology）2材料（儀器）ABI7500熒光定量PCR儀（lifetechnology公司）TGL-16M低溫冷凍離心機(jī)（湘儀）SW-CJ-1D單人凈化工作臺(tái)（瀘凈凈化）HR40-IIA2生物安全柜（Haier）3實(shí)驗(yàn)步驟3.1RNA的抽提RNA的提取按lifetechnology公司提供的TriozolRNA提取試劑盒的使用說明進(jìn)行。程序如下：（1）將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1mlTRIzol；（2）加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管管蓋，上下顛倒混勻60s（請(qǐng)勿渦漩激烈振蕩），室溫靜置3min，12,000g,4^離心15min，置于冰上；（3）溶液分為三層，RNA溶解在水相中，小心吸取500叫水相至另一個(gè)新的RNasefree的EP管中；（4）加入500^1異丙醇，-20度放置1h，12,000g，4^離心10min，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄上清；加入1ml75%乙醇，用手輕輕顛倒，12,000g離心5min,去上清；超凈工作臺(tái)上吹干樣品10min，加入適量DEPC水溶解RNAj^A40叫DEPC水溶解沉淀。3.2RNA質(zhì)量檢測(cè)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度：sampleIDconcentration(ng/同260/280a9981.87b10241.973.3去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65°C條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"5XRTBuffer2gL\o"CurrentDocument"RTEnzymeMix0.5gLPrimerMix0.5gLRNA6gL\o"CurrentDocument"RNase-freeWater1gLToal10gL反應(yīng)條件：37°C,15min98°C,5min4°C,hold反應(yīng)結(jié)束后，-20°C保存。3.4cDNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR3.4.1實(shí)驗(yàn)步驟每個(gè)樣本分別設(shè)置3個(gè)目的基因和3個(gè)內(nèi)參基因的平行實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為20四L，根據(jù)表1.配置。反應(yīng)條件為：95°C2min95°C10s、60°C34s（采集熒光信號(hào)）*45個(gè)循環(huán)72°C30sJ循環(huán)結(jié)束后從60°C升高到98°C獲取熔解曲線。表120"熒光定量PCR反應(yīng)體系試劑體積（gL）終濃度滅菌蒸餾水4.46/Bestar?SybrGreenqPCRmastermix101xForwardPrimer(20pM)0.250.25gMReversePrimer(20pM)0.250.25gM50XRQX0.040.1X模板5/Total20/表2使用的引物基因名稱GenebankID引物序列擴(kuò)增長度（bp）Mus-GAPDHNM_001289726.1Forward：TCCACTCACGGCAAATTCAAC146Reverse：GTAGACTCCACGACATACTCAGCxNM_*****Forward：Reverse：yNM_*****Forward：Reverse：3.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析方法本實(shí)驗(yàn)采用2-△&法進(jìn)行分析，計(jì)算公式為：_「（待測(cè)組目的基因待測(cè)組管家基因）_（對(duì)照組目的基因?qū)φ战M管家基因］F=2t平均ct值平均ct值平均ct值平均ct值F為相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)此次試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，對(duì)照組中的目的基因表達(dá)量為1。4結(jié)果4.1擴(kuò)增曲線dry基因擴(kuò)增曲線4.2熔解曲線GAPDH基因熔解曲線y基因熔解曲線-24.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見EXCE