實驗四血清γ球蛋白的提純詳解演示文稿

實驗四血清γ球蛋白的提純詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)二十四頁\編于十點（優(yōu)選）實驗四血清γ球蛋白的提純目前二頁\總數(shù)二十四頁\編于十點請同學(xué)們清洗自己小組以下用品每個小組：層析柱（1支）比色板（2塊）玻璃棒（1支）離心管（1支）滴管（2支）燒杯（2個）試管（13支）注意實驗過程中每用一次清洗一次！目前三頁\總數(shù)二十四頁\編于十點問題1.血清蛋白質(zhì)的分類？

清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白2.分離純化蛋白質(zhì)的方法？

電泳、透析及超濾、有機溶劑沉淀、鹽析、免疫沉淀、層析、超速離心法等3.鹽析？層析？透析？

加入中性鹽破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素而使其沉淀（水化膜和電荷層）利用各組分理化性質(zhì)不同而分離（本實驗是利用組分分子大小不同而分離）半透膜把大小分子分開4.本實驗鹽析所用硫酸銨飽和度是多少？

33%5.定性檢測蛋白質(zhì)和銨根離子的方法？

縮二脲反應(yīng)（紫紅色）或者與磺柳酸反應(yīng)生成白色沉淀納氏試劑（黃色或棕色）目前四頁\總數(shù)二十四頁\編于十點一.實驗?zāi)康?/p>

1.掌握蛋白質(zhì)分離純化方法；2.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)的基本原理；3.熟悉離心機的操作；4.熟悉蛋白質(zhì)、NH4+定性檢測的方法。目前五頁\總數(shù)二十四頁\編于十點分離純化蛋白質(zhì)的方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析離心膜分離技術(shù)透析超濾目前六頁\總數(shù)二十四頁\編于十點二.實驗原理

本實驗是應(yīng)用相同濃度的硫酸銨反復(fù)鹽析分離血清中的γ-球蛋白，再利用凝膠層析法除鹽，即可得到比較純的γ-球蛋白。

采用鹽析法分離清蛋白（主要是清蛋白），再用透析方法除去小分子物質(zhì)。目前七頁\總數(shù)二十四頁\編于十點二.實驗原理（一）鹽析（salting-out）定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使其從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:破壞蛋白質(zhì)兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點：蛋白質(zhì)不變性，常用方法。目前八頁\總數(shù)二十四頁\編于十點二.實驗原理（二）透析（dialysis）定義：利用半透膜把大小分子分開。透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達到分離的方法。其利用半透膜原理，通過擴散、對流體內(nèi)各種有害以及多余的代謝廢物和過多的電解質(zhì)移出體外，達到凈化血液的目的，并且達到糾正水電解質(zhì)及酸堿平衡的目的。臨床應(yīng)用：血液透析

目前九頁\總數(shù)二十四頁\編于十點二.實驗原理（三）層析（chromatography）

層析技術(shù)是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。

按層析的原理不同可以分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析。（教程P25）

凝膠是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（分子大小不同）

小分子進入凝膠顆粒的微孔中，流程長，下移速度慢；大分子不能進入凝膠顆粒的微孔中去，只能分布在顆粒的間隙中，所以流程短，向下移動速度快。目前十頁\總數(shù)二十四頁\編于十點二.實驗原理凝膠層析法（根據(jù)分子大小差異而分離）目前十一頁\總數(shù)二十四頁\編于十點二.實驗原理（四）離心（centrifuge）

離心技術(shù)是利用離心力，依據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、擴散系數(shù)和浮力密度差異而進行物質(zhì)的分離、濃縮和分析的一種技術(shù)。目前十二頁\總數(shù)二十四頁\編于十點二.實驗原理離心操作要領(lǐng)1、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種離心機操作說明進行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形。2、檢查離心管套筒是否完好、套筒內(nèi)有沒有軟膠墊或棉花。3、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物（配平）。4、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對稱放置。5、啟動離心時離心速度由慢到快。目前十三頁\總數(shù)二十四頁\編于十點二.實驗原理（五）檢測蛋白質(zhì)、NH4+的方法①檢測蛋白質(zhì)縮二脲試劑：溶液顯紫紅色20％磺柳酸：有白色沉淀產(chǎn)生②檢測NH4+

納氏試劑：黃色或棕色目前十四頁\總數(shù)二十四頁\編于十點三.實驗操作1、鹽析2、透析3、層析（脫鹽）4、檢測目前十五頁\總數(shù)二十四頁\編于十點1、鹽析取離心管一支加入血清2ml加入2mlPBS，搖勻逐滴加入pH7.2飽和(NH4)2SO4

2ml,搖勻上清液（主要含清蛋白）傾入試管中靜置10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘沉淀用1mlPBS攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO4

0.5ml,搖勻傾棄上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即為初步純化的γ－球蛋白透析脫鹽靜置10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘用于配平用于配平樣品為豬血清目前十六頁\總數(shù)二十四頁\編于十點2、透析清蛋白

換水①透析袋剛放入水中時,立即取袋外液體檢查有無NH4＋；②每隔4分鐘檢查一次，共3次，比較NH4＋透出的情況。①約0.5小時，檢查袋外液體的NH4＋情況；②取袋外液2滴，置于小試管中，然后滴加20％磺柳酸1~2滴，觀察有無沉淀產(chǎn)生。水

水

目前十七頁\總數(shù)二十四頁\編于十點3、層析

12345678910②上樣γ－球蛋白，PBS10滴溶解

①裝柱

裝柱前用濾紙片堵住層析柱下口，防止下端玻紗堵塞葡聚糖凝膠G－25，柱高3/4~2/3柱長流速：每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑PBS10ml④收集20滴換一支試管目前十八頁\總數(shù)二十四頁\編于十點⑤

層析后洗脫液檢測每組兩塊比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測NH4+）,另一塊滴加縮二脲試劑（檢測蛋白質(zhì)）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應(yīng)此孔顯色劑棄用。檢測蛋白及銨根離子不用滴管,避免污染,直接用試管傾倒。用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺。⑥

回收凝膠目前十九頁\總數(shù)二十四頁\編于十點四.實驗結(jié)果(用+-號表示，不寫顏色)表1.層析后洗脫液的顯色結(jié)果表2.透析后的袋外溶液顯色結(jié)果試管編號12345678910縮二脲試劑檢測后現(xiàn)象納氏試劑檢測后現(xiàn)象檢測次數(shù)123456試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸現(xiàn)象檢測人：時間：檢測人：時間：目前二十頁\總數(shù)二十四頁\編于十點五.注意事項１.正確使用離心機。２.裝柱時檢查層析柱下端是否有濾紙片，是否漏水。３.裝柱后凝膠均一、無斷層，無氣泡，柱床面平整。４.柱床面保持有緩沖液。５.層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。６.每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣品交叉污染。7.兩人一組，分工協(xié)作。目前二十一頁\總數(shù)二十四頁\編于十點思考1.為什么硫酸銨能夠使蛋白質(zhì)沉淀？2.本實驗鹽析所用鹽的飽和度是多少？為什么能夠沉淀γ-球蛋白？3.如何證明分離純化的樣品是何種蛋白質(zhì)？4.兩步鹽析之后，沉淀中含有哪些物質(zhì)？5.層析結(jié)果好壞的判斷標準是什么？6.透析時，燒杯中出現(xiàn)蛋白質(zhì)說明什么問題？目前二十二頁\總數(shù)二十四頁\編于十點預(yù)習(xí)實驗五細胞核的分離與核酸的鑒定1.核酸的基本組成2.DNA和RNA結(jié)構(gòu)及分布區(qū)域3.核酸理化性質(zhì)4.實驗原理及操作5