親和純化技術

關于親和純化技術第1頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2第九章親和純化技術親和純化技術（Affinitypurification）:利用生物分子間的特異性結合作用的原理進行生物物質分離純化的技術“親和力”第2頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月3親和純化技術親和層析(Affinitychromatography)親和過濾（膜分離）親和分配（雙水相萃?。┯H和反膠團萃?。ǚ茨z團萃取）親和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）第3頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月4第一節(jié)親和層析(AffinityChromatography)第4頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月5親和層析第5頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月6第一節(jié)親和層析

(AffinityChromatography)（1）配基固定化：配基與載體偶聯，結合成具有特異親和性的分離介質。（2）吸附樣品：親和層析介質選擇性吸附生物活性物質.（3）樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質解吸。

第6頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月7一、親和層析的原理和特點7利用生物大分子物質具有與某些相應的分子專一性可逆結合的特性而建立的層析技術。適用于從成份復雜且雜質含量遠大于目標物的混合物中提純目標物。經過一次處理可得到高純度活性物質；特異性強、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑。第7頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月8親和吸附劑：載體—配基在親和層析中起可逆結合的特異性物質稱為配基（Ligand）。與配基結合的層析介質稱為載體（Matrix）。第8頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月9配基-底物（Ligand-substance）配基-底物：親和對特異性好通用性差第9頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月10梁山伯朱麗葉楊貴妃小龍女祝英臺林黛玉崔鶯鶯LigandSubstance祝英臺第10頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月11酶受體，載體蛋白凝集素抗原，病毒，細胞谷胱甘肽聚（His）融合蛋白，表面具有Cys/Trp殘基核酸互補堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶，核酸結合蛋白金屬離子谷胱甘肽-S-轉移酶，GST融合蛋白抗體多糖類，糖蛋白，細胞表面受體，細胞激素，維生素底物類似物，抑制劑，輔助因子底物配基第11頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月12二、載體（一）、親和層析對載體的要求：第12頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月13（二）、常用載體第13頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月141、纖維素纖維素結構緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強，空間位阻。主要用于分離與核酸有關的物質。第14頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月152、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質活性，能迅速活化并接上各種功能基團，結構疏松孔徑大，流速快。SepharoseCL,穩(wěn)定性明顯增加，能在pH3~14中應用。

第15頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月16

3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯配基后，孔徑更小，應用受到限制。

第16頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月174、聚丙烯酰胺凝膠：Bio-gelP有供化學反應的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。

pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。第17頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月18

5、多孔玻璃珠：化學與物理穩(wěn)定性較好，機械強度高。缺點：親水性不強，對蛋白質尤其是堿性蛋白質有非特異性吸附，化學活性基團少。第18頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月196、其它載體——殼聚糖(Chitosan)

甲殼素和殼聚糖殼聚糖是甲殼素N-脫乙酰基的產物第19頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月20三、親和配基第20頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月21（一）、配基的選擇第21頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月22（二）、配基的濃度對親和勢比較低的系統(tǒng)（KL≥10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。配基濃度太高使吸附力太強，洗脫困難?？梢酝ㄟ^增加親和柱的長度來提高吸附率。第22頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月23（三）、配基偶聯的位置配基固定化時，其不參與親和結合的部位與載體進行偶聯。AMP-Sepharose親和柱腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，對甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。例：第23頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月24（四）、配基分子的大小

選用大分子配基。小分子物質作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。第24頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月25四、載體的活化與偶聯Q:載體在于配基偶聯前為什么要“活化”？A：載體相對“惰性”，不能直接與配基連接（不容易發(fā)生化學反應），因此在偶聯前（載體與配基對接），需要對載體進行“活化”活化的方式有很多種……第25頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月26載體的活化的方式多糖類載體第26頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月27聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法酰胺基+含氮化合物→胺衍生物第27頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月28五、影響吸附親和力的幾個因素

第28頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月29※六、配基與間隔臂的連接（一）、含氮配基的連接（二）、含羧基配基的連接（三）、含巰基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接第29頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月30七、親和層析的吸附和洗脫

第30頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月31第31頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月32（一）、影響吸附的條件1、親和吸附劑及配體的性質緩沖液的種類、離子強度、pH、溫度和層析流速有關。2、溫度升高會使吸附作用減弱。3、流速每小時低于10ml/cm2。4、上樣體積為柱床體積的5%。第32頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月33第33頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月34離子效應配基與載體-間隔臂的不完全結合，將無關離子基團引入吸附劑。具有離子基團的親和吸附劑會影響蛋白質的洗脫行為。第34頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月35疏水基團吸附劑疏水性基團與蛋白質結構中的疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性吸附。疏水基團：（1）長的烴鏈結構的“手臂”：烴鏈（2）疏水性配基第35頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月36復合親和力離子效應作用，又有疏水作用。提高選擇性對每一具體系統(tǒng)找出最佳的配給濃度、pH、離子強度和溫度。第36頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月37（二）、親和層析的洗脫第37頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月38非專一性洗脫改變洗脫劑的pH以影響電性基團的解離程度離子強度的分步和梯度變化降低緩沖液極性第38頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月39特殊洗脫斷裂方法有：硫酯鍵用羥胺處理30分鐘；偶氮鍵用連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等處理。第39頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月40專一性洗脫競爭性效應——正洗脫非競爭性效應——不能達到洗脫目的反競爭性效應——負洗脫第40頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月41專一性洗脫競爭性效應，即ESI不如EI穩(wěn)定，增加洗脫劑中I，會使E洗脫下來（正洗脫）。S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）第41頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月42專一性洗脫非競爭性效應，即ESI穩(wěn)定性與EI相同，I的存在不影響E對S的結合，用I不能達到洗脫的目的。S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）第42頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月43專一性洗脫反競爭性效應，即ESI比EI穩(wěn)定，I使E與S結合更緊密。增加了酶與配基的結合力及親和吸附的選擇性將I除去——“負洗脫”第43頁，課件共47頁，創(chuàng)作于202