目的基因的獲得

學(xué)習(xí)情境4

微生物工程菌發(fā)酵制藥技術(shù)目的基因的獲得目的基因的獲得對(duì)于真核細(xì)胞來(lái)源的目的基因，是不能直接進(jìn)行分離的。真核細(xì)胞中單拷貝基因僅是染色體DNA中的很小一部分，即使多拷貝基因也是極少的，因此從染色體中分離純化目的基因是很困難的。另外，原核表達(dá)系統(tǒng)是有局限性的，主要是由于真核基因的內(nèi)含子及基因的后翻譯過(guò)程，所以真核系統(tǒng)得到了相應(yīng)發(fā)展。目的基因—是指待在受體細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，也稱供體基因。對(duì)于目的基因的獲得需要根據(jù)目的基因的來(lái)源采取適當(dāng)?shù)姆椒?。目前克隆基因常用的方法有鳥槍法、逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法鳥槍法（Shotgunmethod）：使用基因組中的隨機(jī)產(chǎn)生的片段作為模板進(jìn)行克隆的方法。

使用限制性內(nèi)切酶將帶有目的基因的DNA鏈切成若干小段

再使用DNA連接酶將其整合到載體的基因中,并使其表達(dá)

如果在某個(gè)細(xì)胞中得到了目的產(chǎn)物,就說(shuō)明整合到該細(xì)胞中的DNA片斷就是所需要的DNA片斷1.鳥槍法2.逆轉(zhuǎn)錄法（cDNA）

逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá)。為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列，可從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。cDNA與模板mRNA序列嚴(yán)格互補(bǔ)，而不含內(nèi)含子。cDNA克隆示意圖1、mRNA的純化2、cDNA第一鏈的合成3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA克隆5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞6、cDNA文庫(kù)的鑒定7、目的cDNA克隆的分離和鑒定mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNADNA多聚酶IKlenow片段逆轉(zhuǎn)錄酶ds-cDNAds-cDNA3.人工合成法人工化學(xué)合成的限制：一不能合成太長(zhǎng)的基因，50~60bp；二是人工合成時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可導(dǎo)致中性突變；三是費(fèi)用較高?；虻娜斯ず铣删褪侵赣糜袡C(jī)化學(xué)合成和酶促合成的方法，使單核昔酸通過(guò)3',5’磷酸二醋鍵連接成寡核昔酸，多核昔酸和具有生物活性的完整的核酸分子。分離得到含有目的基因的陽(yáng)性克隆后，必須對(duì)其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定，主要是進(jìn)行限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位