實驗大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

關(guān)于實驗大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化第1頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容一：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒瀮x器、材料、試劑實驗步驟

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4注意事項思考題

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6第2頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康?/p>

掌握感受態(tài)細(xì)胞的概念及其意義。

掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備原理與操作方法。第3頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理感受態(tài)：受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。制備感受態(tài)的細(xì)胞一般選擇對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。常用的感受態(tài)制備方法包括KCl、CaCl2等方法；后者因為操作簡便且符合大多數(shù)的分子克隆要求，因而被廣泛采用。第4頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月

CaCl2

法的基本原理：細(xì)菌處于低溫（0℃）和低滲的CaCl2溶液中，菌體膨脹，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于菌體表面，在42℃進(jìn)行短時間的熱激處理，促進(jìn)DNA的吸收。實驗原理第5頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月CaCl2

法簡便易行，用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5106-2107個轉(zhuǎn)化菌落。在實際工作中，每微克有105以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一般的克隆實驗。

制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃，可以保存半年。實驗原理第6頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月提高轉(zhuǎn)化效率要考慮幾個重要因素：實驗原理

1、細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于4℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。

細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600

來控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時，細(xì)胞密度在5×107

個/ml左右。第7頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。

1ng的超螺旋態(tài)DNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。實驗原理第8頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2

等均需是最高純度的，并用超純水配制，并用微孔濾膜過濾滅菌，最好分裝保存于干燥的冷暗處。實驗原理第9頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月4、防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。實驗原理第10頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗儀器、材料、試劑1、儀器：高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、臺式

離心機(jī)、無菌操作臺、微量移液

器、恒溫?fù)u床；2、材料：菌種E.coliDH5α；3、試劑：LB液體培養(yǎng)基、0.1MCaCl2。第11頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、將E.coliDH5α單菌落接種于3mlLB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。2、取30μl液體培養(yǎng)液加入3mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃下震蕩培養(yǎng)，至光密度值OD600在0.5~0.6之間（5×107

個/ml）。

3、取1mlE.coli液體培養(yǎng)液于1.5ml的離心管中，4000rpm，4℃離心3min。實驗步驟第12頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月4、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰

冷的0.1MCaCl2溶液，使沉淀充分懸浮，動

作要輕柔，置于冰上30min，4000rpm，4℃離心3min。5、棄上清，加入lml凍存液（含15%甘油的0.1MCaCl2溶液）溶液，使沉淀充分懸浮，以每管0.1ml的規(guī)格分裝3管，凍存于-80℃，可保存4~6個月。實驗步驟第13頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項1、不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲存與4℃的培養(yǎng)菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接

轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。2、細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為宜，可以通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600控制。DH5α菌株的OD600為0.5時，細(xì)胞密度比

較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化

效率。第14頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項3、進(jìn)行熱激制備感受態(tài)細(xì)胞時要控制好

時間。4、懸浮細(xì)胞時動作要輕柔，以免造成菌

體破裂，影響轉(zhuǎn)化。第15頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題1、影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素有哪

些？第16頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容二：質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化體篩選實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒瀮x器、材料、試劑實驗步驟

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4注意事項思考題

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6第17頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康牧私廪D(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中

的意義。學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞及篩

選重組子的方法。第18頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，并使其生物學(xué)特性發(fā)生可遺傳的變化的過程，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。

第19頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化的方法：

(1)化學(xué)的方法(熱激法)：使用化學(xué)試劑(如CaCl2)制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱激處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；

(2)電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。實驗原理第20頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞使其處于感受態(tài)后，通過熱激處理可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌中。進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒能夠自主復(fù)制并在宿主中實現(xiàn)其攜帶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。實驗原理第21頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理第22頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化體的篩選方法：主要用不同抗生素基因篩選。

常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等。實驗原理第23頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細(xì)菌菌落，將難以確認(rèn)哪一個克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。實驗原理第24頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月本實驗使用的pGEX-4T-2質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp)，理論上只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含Amp的培養(yǎng)基生長。但抗性篩選只是初步的篩選，可能仍有部分未轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)菌能在抗性培養(yǎng)基上生存（假陽性），因此還需要通過提取質(zhì)粒酶切、電泳作進(jìn)一步的鑒定。實驗原理第25頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗儀器、材料、試劑1、儀器：恒溫?fù)u床，恒溫水浴鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，無菌工作臺，微量移液槍。2、材料：DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒pGEX-4T23、試劑：LB液體及固體培養(yǎng)基、氨芐青霉

素Amp（50mg/ml）。第26頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗步驟1、每100ul感受態(tài)細(xì)胞加入1ul質(zhì)粒DNA，

同時做一個空