上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)課件 20、賽沛馬林-分子診斷POCT的進(jìn)展與臨床應(yīng)用

分子診斷POC

進(jìn)展及臨床應(yīng)用馬林Cepheid1?Cepheid內(nèi)容分子診斷領(lǐng)域的革新POCT分子診斷技術(shù)分子診斷POCT的臨床應(yīng)用2?Cepheid分子診斷領(lǐng)域的革新3?Cepheid近期分子診斷發(fā)生了哪些革新？更快的單個(gè)項(xiàng)目檢測(cè)(15分鐘)如

流感更多的檢測(cè)菜單

(>20)可檢測(cè)血液、呼吸道樣本、胃腸樣本和腦膜炎/腦炎4?Cepheid商業(yè)化分子診斷平臺(tái):

>20

項(xiàng)檢測(cè)Biofire/bioMérieux

filmarrayCepheidGeneXpertBDMAXAlere

iRocheLightCyclerbioMérieux

NucliSensEasyQNanosphere

Verigene實(shí)例：陽性血培養(yǎng)物的多重檢測(cè)菜單為什么應(yīng)用分子診斷檢測(cè)？?

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法過于耗時(shí)?

改善結(jié)核診斷（2小時(shí)

vs

3-4周）?

傳統(tǒng)檢測(cè)方法靈敏度欠佳?

替代不準(zhǔn)確的快速流感病毒檢測(cè)?

沒有合適的傳統(tǒng)檢測(cè)方法?

諾如病毒的檢測(cè)?

改善抗菌藥物管理?

快速獲得檢測(cè)結(jié)果可以指導(dǎo)抗菌、抗真菌、抗病毒藥物的使用7?Cepheid何時(shí)需要改善診斷并保證經(jīng)濟(jì)效益？?

敗血癥患者需要快速確認(rèn)正確的抗生素療法?

疑似肺結(jié)核、流感患者?

急診的腦膜炎兒童?

孕婦：B族鏈球菌定植?

性傳播疾病就診患者：淋球菌和沙眼衣原體8?Cepheid結(jié)果耗時(shí)、臨床價(jià)值低

–

需要改變感染報(bào)告發(fā)給臨床醫(yī)生藥敏試驗(yàn)

(難培養(yǎng))藥敏試驗(yàn)初始報(bào)告培養(yǎng)96(4天!!!)48小時(shí)7224采樣9?Cepheid分子診斷帶來革新采樣/培養(yǎng)陽性物啟動(dòng)最佳的抗菌治療方案PCR報(bào)告混合感染給到臨床醫(yī)生藥敏試驗(yàn)

(難培養(yǎng))藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)01-324小時(shí)PCR

檢測(cè)分子診斷檢測(cè)血培養(yǎng)示例：

S.aureus,

MRSA,

CoNS簇狀排列的革蘭氏陽性球菌PCR法檢測(cè)

MRSA/SA

(GeneXpert

1小時(shí))納米探針的PCR/芯片法：

Nanosphere

(3

小時(shí))Filmarray

(BioFire):

S.aureus,mecA耐藥基因(1

小時(shí))ALDI-TOFIDPNA

-FISH

~30分鐘

MRSA

快速篩查11

?CepheidPOC

分子診斷技術(shù)12

?Cepheid傳統(tǒng)分子檢測(cè)流程樣本采集和處理DNA/RNA提取純化濃度純度質(zhì)控普通PCR電泳/測(cè)序/芯片PCR體系構(gòu)建Real-time

PCR13

?Cepheid標(biāo)準(zhǔn)PC

實(shí)驗(yàn)室?

分區(qū)：3-4室?

單向氣流?

目的：防止污染！新一代快速的POC

分子診斷平臺(tái)GeneXpert?Omni15

?CepheidBioFire

FilmArray核酸提取和制備核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)16

?CepheidBioFire

FilmArrayFilm=塑料膜Array=陣列17

?CepheidFilmArray

工作原理試劑儲(chǔ)存區(qū)化學(xué)反應(yīng)區(qū)核酸的提取與純化第一階段多重PCR反應(yīng)第二階段巢式PCR反應(yīng)18

?CepheidFilmArray工作原理65分鐘運(yùn)行時(shí)間8.

FilmArray儀器測(cè)試每個(gè)小孔中產(chǎn)物的熔解曲線，以判斷是否存在待測(cè)產(chǎn)物。19

?CepheidFilmArray

質(zhì)控?

全程內(nèi)參——DNA/RNA處理對(duì)照干粉狀態(tài)的Schizosaccharomyces

pombe從第一步開始，同樣本一同進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?

擴(kuò)增內(nèi)參——第二階段PCR對(duì)照陣列內(nèi)帶有已知的DNA模板序列第二階段PCR對(duì)照DNA/RNA處理對(duì)照20

?Cepheid結(jié)果分析?

所有靶標(biāo)都重復(fù)測(cè)試3次?

三次測(cè)試中，2個(gè)以上陽性才會(huì)判讀為陽性?

熔解曲線峰值必須處于正確溫度區(qū)間?

重復(fù)測(cè)試的熔解曲線峰值必須高度一致?

兩個(gè)內(nèi)參必須都檢出(全程內(nèi)參和擴(kuò)增內(nèi)參)Bordetellapertussis21

?CepheidGENEXPER

系統(tǒng)‘分子診斷服務(wù)器’架構(gòu)使得系統(tǒng)通量可以隨測(cè)試量的增長而上升?

模塊獨(dú)立，隨來隨做GeneXper

模塊柱塞桿馬達(dá)主板I-CORE閥驅(qū)動(dòng)馬達(dá)試劑盒裝載倉室超聲變幅器23

?Cepheid試劑盒中的PC

實(shí)驗(yàn)室24

?CepheidGeneXper

試劑盒設(shè)計(jì)傳統(tǒng)PCR檢測(cè)需要3個(gè)獨(dú)立分Xpert試劑盒自帶11個(gè)獨(dú)立腔道，在單一試劑盒中即可完成樣本核酸提取、反應(yīng)體系配置及PCR檢測(cè)區(qū)房間25

?CepheidGeneXper

設(shè)計(jì)理念系統(tǒng)與試劑盒之間無“濕性”界面，整個(gè)過程封閉操作，杜絕污染系統(tǒng)中整合超聲破碎，可快速裂解細(xì)胞每個(gè)試劑盒中都包含質(zhì)控

—

無需額外的外部陽性或陰性質(zhì)控智能流體學(xué)設(shè)計(jì)

軟件操控馬達(dá)，完成活塞桿提升下降、腔道開放關(guān)閉及液體流動(dòng)

精準(zhǔn)的微流體力學(xué)技術(shù)，可完成復(fù)雜的各種標(biāo)本制備程序

(從數(shù)ml至10μl)自動(dòng)分析數(shù)據(jù)并解讀結(jié)果26

?CepheidGeneXper

檢測(cè)原理及質(zhì)控示例?

5條重疊探針–

只與野生型基因片段但不和突變的序列相結(jié)合?

1條探針檢測(cè)樣本處理質(zhì)控-SPC(球芽孢桿菌)?

共有6種熒光染料同時(shí)檢測(cè)27

?Cepheid內(nèi)部質(zhì)控

探針檢查質(zhì)控(PCC)?

探針檢查質(zhì)控(PCC)–

在熱循環(huán)啟動(dòng)之前，測(cè)試不同溫度下熒光信號(hào)讀數(shù)值，從而評(píng)估試劑盒內(nèi)試劑是否能正常反應(yīng).?

PCC可以驗(yàn)證:?

試劑珠再水化?

PCR反應(yīng)管填充?

探針的完整性?

熒光染料或試劑/熒光淬滅劑的穩(wěn)定性?

結(jié)果自動(dòng)與軟件中廠家預(yù)設(shè)的參數(shù)進(jìn)行比較?

終止測(cè)試，如果探針檢查未通過28

?Cepheid內(nèi)部質(zhì)控

樣本處理質(zhì)控(SPC)?

樣本處理質(zhì)控

(SPC)?

非感染性的芽胞?

驗(yàn)證菌體是否能夠成功裂解?

檢測(cè)體系中是否存在與標(biāo)本有關(guān)的擴(kuò)增抑制因子：如果樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性，則SPC檢測(cè)應(yīng)為陽性；如果樣本檢測(cè)結(jié)果為陽性，則SPC檢測(cè)可為陰性，也可為陽性.?

如果樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性，而SPC檢測(cè)也為陰性，則樣本檢測(cè)結(jié)果無效29

?CepheidXper

MTB/RIF結(jié)果判讀法則30

?CepheidGeneXper

檢測(cè)結(jié)果示例結(jié)果解釋樣本及測(cè)試信息實(shí)時(shí)

PCR擴(kuò)增曲線PAGE

|

3131

?CepheidGeneXper

檢測(cè)結(jié)果示例32

?Cepheid其他檢測(cè)示例：CT/NG

及HI

病毒載量33

?CepheidXper

檢測(cè)試劑盒的內(nèi)部質(zhì)控特性PCC探SAC樣本充分性質(zhì)控SPC樣本檢測(cè)結(jié)果（如果質(zhì)控失敗）檢測(cè)步驟驗(yàn)證方面檢查狀態(tài)

針檢查質(zhì)控處理質(zhì)控光學(xué)、機(jī)械、濕度、檢測(cè)盒完整性XX錯(cuò)誤錯(cuò)誤儀器檢查狀態(tài)聲波降解控制*樣本中有足量的人類細(xì)胞*XX無效**無效**核酸提取X樣本處理與PCR反應(yīng)混

適當(dāng)數(shù)量的試劑微珠X錯(cuò)誤錯(cuò)誤錯(cuò)誤錯(cuò)誤合物的制備探針完整性XPCR反應(yīng)管完全填充PCR反應(yīng)的適宜反應(yīng)條件XXXXXX無過量PCR抑制劑無效**34

?CepheidRoche

cobas

Liat?

現(xiàn)有測(cè)試?

cobas?

InfluenzaA/B?

cobas?

StrepA?

cobas?

InfluenzaA/B&RSV?

報(bào)告時(shí)間：15-20分鐘35

?Cepheid–

Confidential.

For

internaluse

only.Alere

i?

現(xiàn)有測(cè)試?

Alere

?

iInfluenzaA&Btest?

Alere

?

iRSVtest?

Alere

?

iStrepAtest?

報(bào)告時(shí)間：<15分鐘36

?Cepheid–

Confidential.

For

internaluse

only.分子診斷POC

技術(shù)的臨床應(yīng)用37

?CepheidFilmArrayRP

Pane

上呼吸道感染測(cè)試病毒(17種):腺病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒冠狀病毒HKU1冠狀病毒NL63冠狀病毒229E冠狀病毒OC43人類偏肺病毒人鼻病毒/腸病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亞型甲型流感病毒H1-2009亞型甲型流感病毒H3亞型乙型流感病毒細(xì)菌(3種):百日咳桿菌肺炎衣原體肺炎支原體3838

?CepheidFilmArrayGI

Pane

胃腸道感染測(cè)試細(xì)菌(7種):寄生蟲(4種):隱孢子蟲彎曲菌(空腸、結(jié)腸、烏普薩拉)難辨梭菌(毒素A/B)類志賀鄰單胞菌沙門菌環(huán)孢子蟲痢疾阿米巴蘭伯氏賈第鞭毛蟲弧菌(副溶血、創(chuàng)傷、霍亂)霍亂弧菌病毒(5種):小腸結(jié)腸耶爾森菌腺病毒F組40/41星狀病毒致瀉大腸埃希菌/志賀菌(6種):腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)腸致病性大腸埃希菌(EPEC)產(chǎn)類志賀毒素大腸埃希菌(STEC)大腸埃希菌O157諾如病毒GI/GII輪狀病毒

A群札如病毒(I,

II,IV和V型)志賀菌/腸侵入性大腸埃希菌(EIEC)39

?CepheidFilmArrayME

Pane

腦膜炎

腦炎測(cè)試病毒(7種):細(xì)菌(6種):巨細(xì)胞病毒(CMV)腸病毒單純皰疹病毒1

型(HSV-1)單純皰疹病毒

2型(HSV-2)人皰疹病毒6型(HHV-6)人雙?？刹《敬竽c埃希菌流感嗜血桿菌單核細(xì)胞增生李斯特菌腦膜炎奈瑟菌無乳鏈球菌肺炎鏈球菌水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)真菌(1種):新型隱球菌C.

neoformans/C.

gattii40

?CepheidPCR檢測(cè)培養(yǎng)/藥敏(Hours

toappropriate

Rx)(Hours

onwrong

Rx)患者獲得正確療法的時(shí)間快了10倍/結(jié)束錯(cuò)誤療法的時(shí)間縮短4倍挽救生命，減少醫(yī)療支出41

?CepheidGeneXper

檢測(cè)菜單當(dāng)前檢測(cè)開發(fā)中的檢測(cè)MRSA(MRSA主動(dòng)監(jiān)測(cè))TB

XDR

（結(jié)核多重耐藥）SA

Nasal

Complete(SA/MRSA主動(dòng)監(jiān)測(cè))MRSASSTI/BC皮膚和血培養(yǎng)MRSA診斷C.difficile(產(chǎn)毒艱難梭菌)胃腸道多重檢測(cè)XpressPertussis（百日咳）XpressGBSUltra（超敏GBS）CMV

ViralLoad（巨細(xì)胞病毒載量）HBVViralLoad（HBV病毒載量）HCVFSVL（指尖血HCV病毒載量）Norovirus(諾如病毒)vanA/vanB(耐萬古霉素腸球菌）Carba-R(耐碳青霉烯腸桿菌5種基因型檢測(cè))MTB/RIF

(結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥)Enterovirus

(腸道病毒)XpressFlu/RSV(流感病毒A/B與呼吸道合胞病毒)Ebola(埃博拉病毒)胰腺癌早期檢測(cè)乳腺癌監(jiān)測(cè)前列腺癌早期檢測(cè)EGFRMonitor

(肺)肺癌早期檢測(cè)CT/NG(沙眼衣原體/淋球菌)Trichomonas

(陰道毛滴蟲)GBS(B族鏈球菌篩查)HPVHIV-1Qualitative（HIV定性）HIV-1ViralLoad（HIV-1病毒載量）HCVViralLoad（超敏HCV病毒載量）BCR-ABL

Ultra(慢性粒細(xì)胞白血病融合基因)FII&FV42

?CepheidXper

MTB/RIF

結(jié)核分枝桿菌與耐藥檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)自動(dòng)完成痰標(biāo)本與處理液1：2混合標(biāo)本自動(dòng)清洗過濾超聲裂解DNA提純DNA和PCR反應(yīng)半巢式實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑混合打印檢測(cè)報(bào)告吸取2ml處理樣品到反應(yīng)盒將反應(yīng)盒放入檢測(cè)模塊（手工操作完成）獲得檢測(cè)結(jié)果時(shí)間：1小時(shí)50分鐘Source:Boehmeet

al.,NEJM201043

?Cepheid結(jié)核病的分散式檢測(cè)移動(dòng)TB檢測(cè)站坦桑尼亞太陽能TB檢測(cè)烏干達(dá)快速分子診斷方法檢測(cè)Fl

及RS

的必要性?

快速酶聯(lián)免疫測(cè)試的靈敏度僅在50%-70%之間

–

陰性結(jié)果需病毒培養(yǎng)確認(rèn)?

呼吸道合胞病毒快速抗原檢測(cè)試劑在成人診斷中的平均靈敏度為

29%?

流感和呼吸道合胞病毒的流行季經(jīng)常重疊且臨床癥狀相似–

因此很難在兩種感染之間進(jìn)行明確的區(qū)分?

流感有對(duì)應(yīng)的抗病毒治療策略但RSV沒有*Harper

et

al.,Seasonal

Influenza

inAdultsand

Children—Diagnosis,Treatment,

Chemoprophylaxis,

and

InstitutionalOutbreak

Management:

Clinical

Practice

Guidelines

of

theInfectiousDiseasesSociety

of

America,

Clinical

InfectiousDiseases2009.

/rsv/about/faq.html**Banerjiet

al.Pediatr

InfectDisJ.2009

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doi:

10.1097/INF.0b013e31