PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒演示文稿

PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)優(yōu)選PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒目前二頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)

乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國(guó)發(fā)病率很高，HBV的檢測(cè)極其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)制的發(fā)動(dòng)機(jī)。目前三頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)PCR技術(shù)可以檢測(cè)出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術(shù)已成為公認(rèn)的對(duì)病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。目前四頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理2.熟悉PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒的基本操作過(guò)程。目前五頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)簡(jiǎn)稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對(duì)引物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)，它包括三個(gè)基本過(guò)程：目前六頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)1.變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?.退火：急速降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部形成雜交鏈3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)目前七頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)模板DNA高溫變性低溫退火引物適溫延伸經(jīng)過(guò)25-35次循環(huán)后，目的片段擴(kuò)增2n倍兩條子代DNA一次循環(huán)Tap酶5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’目前八頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)三、主要器材及試劑1.主要器材：9700型PCR儀電泳槽、電泳儀目前九頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)

紫外分析儀臺(tái)式高速離心機(jī)目前十頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)2.主要試劑：HBV-PCR定性檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)管HBV陽(yáng)性標(biāo)本DNA提取液目前十一頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)四、操作步驟1.標(biāo)本處理：取患者血清40μl，加入DNA提取液40μl，沸水浴10分鐘，10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。目前十二頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)2.加樣：加入提取好的標(biāo)本4μl，6000轉(zhuǎn)離心10秒。取試劑盒中PCR反應(yīng)管

TapDNA聚合酶10×擴(kuò)增緩沖液

4種dNTP混合物引物(小分子DNA片段）

Mg2+目前十三頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)三個(gè)擴(kuò)增步驟溫度及時(shí)間溫度時(shí)間變性93℃45″（首次5′）退火55℃45″延伸72℃60″（末次5′）循環(huán)次數(shù)：25次3.PCR儀上擴(kuò)增：目前十四頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)PCR儀上擴(kuò)增加入標(biāo)本離心6000轉(zhuǎn)離心10秒目前十五頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)4.電泳檢測(cè)：①制備2%瓊脂糖凝膠

2%瓊脂糖的制備：電泳槽的準(zhǔn)備：稱取0.8g瓊脂糖40mlTBE電泳緩沖液（PH8.0)煮沸溶解加入冷卻60℃左右加入溴乙啶EB20μl倒膠目前十六頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)``②加樣：取擴(kuò)增后的產(chǎn)物10ul點(diǎn)樣于凝膠孔取樣點(diǎn)樣目前十七頁(yè)\總數(shù)十八頁(yè)\編于十五點(diǎn)③電泳：點(diǎn)樣端接“-”，穩(wěn)壓，50V，電泳30分鐘。