Q第十章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

第十章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)Chapter10TechnologyofPolymeraseChainReaction,(PCR)目前一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)內(nèi)容PCR的概念及技術(shù)的創(chuàng)建PCR的基本原理及特點(diǎn)PCR的反應(yīng)體系和條件優(yōu)化PCR產(chǎn)物分析PCR常用技術(shù)和應(yīng)用目前二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)KaryBMullis

(1944-)

1983年發(fā)明了PCR技術(shù)

1993年度獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)目前三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：templateDNA（genomicDNA

），RNAprimer，dNTPs酶：解旋酶，引物酶，

DNA聚合酶，連接酶反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37℃

反應(yīng)過(guò)程：起始（模板DNA解鏈、形成引發(fā)體）、延長(zhǎng)、終止（三階段）產(chǎn)物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍PCR：templateDNA（genomicDNA，cDNA）,apairofspecificoligonucleotideprimer，dNTPsDNApolymerasebuffer，三種變化的溫度（94，50-70，72℃），cycles（25-35）denaturation、annealing、extension（三階段，多循環(huán)）目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍目前五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR技術(shù)的基本原理屬于無(wú)細(xì)胞的分子克隆，在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對(duì)合成DNA的引物,通過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。目前六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)Denaturing95?CAnnealingTm-5?CExtension72?CPCR的原理目前七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR的過(guò)程（1）第一步

變性（denature）94-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步

復(fù)性（anneal）50-60oC下1分鐘，引物與模板復(fù)性。①引物的濃度高，②引物的鏈短。目前八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（4）第四步

變性（denature）72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步

延伸（extend）（5）第五步

重復(fù)（repeat）目前九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR反應(yīng)條件變性95℃5min變性95℃1min退火55℃1min延伸72℃1min延伸72℃1min35cycles變性95℃延伸72℃退火Tm-5℃目前十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR

PrincipletemplatedenaturatationPrimerannealingPrimerextension目前十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性靈敏度高指數(shù)增長(zhǎng)，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平簡(jiǎn)便、快速2～4小時(shí)完成擴(kuò)增對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。目前十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR儀目前十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR反應(yīng)目前十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul目前十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)自從H.A.Erilish分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37oC)，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。（1）TaqDNA聚合酶

PCR體系組成TaqDNA聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過(guò)程的反復(fù)高溫變性要求。①

熱穩(wěn)定性目前十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)最適溫度：

72-78oC延伸速度：

約1000nt/min酶分子最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度：6.7kb②

最適溫度高③

Taq酶的功能與缺點(diǎn)具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但沒(méi)有3’5’外切酶活性。合成超過(guò)600bp長(zhǎng)度的DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。目前十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)金屬離子敏感（尤其是Mg2+）。當(dāng)dNTP（能結(jié)合Mg2+）的濃度為0.7-0.8mmol/L時(shí)，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。④

TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。目前十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補(bǔ)（

5‘端相同）的短DNA。（2）引物（primer)①位置3’

3’

目前二十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)即2.751011bp的基因組中有一次完全與19個(gè)核苷酸的序列相同的機(jī)會(huì)（或機(jī)會(huì)是約2×10-11）。②引物的長(zhǎng)度理論計(jì)算：419=2.751011。一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)15-30bp。目前二十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)③引物的堿基序列5’端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必須與模板正確配對(duì)，5’端可以不配對(duì)。templateprimer目前二十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力④引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列.

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T發(fā)卡結(jié)構(gòu)1）2）目前二十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)3）避免形成引物二聚體（dimer）兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer目前二十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2當(dāng)引物中的（G+C）含量低于50%時(shí)，復(fù)性溫度低于55oC。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于Tm值5oC。手工計(jì)算：一般估計(jì)：目前二十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)⑥引物的濃度一般使用終濃度各0.2mol/L。⑦簡(jiǎn)并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來(lái)的，就必須考慮密碼的簡(jiǎn)并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個(gè)或幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱簡(jiǎn)并引物。目前二十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用專業(yè)軟件⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer6.0等目前二十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)dNTP呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性分解dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)小量分裝，-20℃冰凍保存，多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，濃度過(guò)低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性（3）dNTP目前二十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)（4）模板DNA但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。②

模板的量：不能太多，100l反應(yīng)體系中100ng足夠。①

純度：PCR對(duì)模板DNA的純度要求不高。目前二十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，dNTP濃度200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低

TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少（5）Mg2+目前三十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）目前三十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)1、溫度

變性溫度：94-97℃退火溫度：低于引物Tm5℃左右，一般55-60℃溫度過(guò)高：降低擴(kuò)增效率；溫度過(guò)低：增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度：72℃，此時(shí)Taq酶具有較高的酶促活性目前三十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)2、時(shí)間

第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（5-7分鐘）每一個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，一般為復(fù)性時(shí)間：30～60sec

延伸時(shí)間：1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min3-4Kb的DNA片段，延伸時(shí)間3-4min10Kb的DNA片段，延伸時(shí)間15min目前三十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)3、循環(huán)次數(shù)

重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25～35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)：理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增25-25個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng)目前三十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR反應(yīng)曲線目前三十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR產(chǎn)物分析

AnalysisofPCRproductsGelanalysis(瓊脂糖凝膠電泳/聚丙烯酰胺凝膠電泳):PCR產(chǎn)物電泳，EB（溴乙錠）染色，紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。目前三十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)Restriction-endonucleasedigestionanalysis：酶切、電泳分離。產(chǎn)物的鑒定，基因分型，研究變異性。目前三十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)Hybridization：

(Southernblot/dotblot)electrophoresis/hybridization目前三十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)Sequenceanalysis：是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。目前三十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)常用PCR技術(shù)原位PCR(insituPCR)多重PCR（multiplexPCR）長(zhǎng)距離PCR(Long-rangePCR)逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）熒光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）巢式PCR（nestingPCR）-4條引物目前四十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)原位ＰＣＲ（InsituPCR）原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InsituPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列目前四十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)

原位PCR的作用

利用該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測(cè)細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。目前四十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)多重PCR（MultiplexPCR復(fù)合PCR）用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。目前四十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)電泳引物12341234目前四十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)RT-PCR（reversetranscription-PCR）Temin,H.發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶，1975諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)關(guān)鍵：利用逆轉(zhuǎn)錄酶，把mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目前四十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶目前四十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR-RFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性1.分析已知突變。2.突變堿基涉及酶切位點(diǎn)的變化。PCR----酶切------電泳目前四十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)PCR-RFLP5’CCACGG3’3’GGTGCC5’*5’CCATGG3’3’

GGTACC5’*ResistancetoNcoIDigestionSusceptibletoNcoIDigestion目前四十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)HomozygousMutantHomozygousWild-typeHeterozygoteDirectionofElectrophoresisPCR-RFLP目前四十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)SSCPPCRPCRATCGWildAmplifyregionofinterestedDenaturesamplesinFormamideorHeatATCGMutant目前五十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)DenaturesamplesinFormamideandHeatATCGATCGDNAmoleculesconformationdependsontheirsequenceRunonaNon-denaturinggelandlookformobilitydifferencesWildMutantSSCP目前五十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)點(diǎn)突變位于酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變：限制性酶切片段分析法不在酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP)

致病基因上的未知點(diǎn)突變：PCR-SSCP（單核苷酸多態(tài)性，SNP）目前五十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)常規(guī)定量PCR技術(shù)：

—對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量

—重復(fù)性差

—半定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量

目前五十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。Ct值是熒光定量PCR技術(shù)的一個(gè)很重要的概念C代表Cycle，t代表threshold(熒光域值)。含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

目前五十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十六點(diǎn)熒光化學(xué)

熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：

—熒光探針

—熒光染料目前五十五頁(yè)