蛋白偶聯(lián)受體的探索之路記省略和briank kobilka

SCIENTIASINICA

42卷第12期1018~

G蛋白偶聯(lián)受體的探索—記 爾化學(xué)獎(jiǎng)得主RobertJ.Lefkowitz和BrianK.,第三醫(yī)院血管醫(yī)學(xué),心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽,分子心血管學(xué)教育部,心血管受體研究北京市,100191*聯(lián)系人E-mail:國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際合作與交流項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào):30910103902)和國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): :10.1360/052012-395化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了RobertJ.LefkowitzBrianK.Kobilka,基于他們?cè)贕蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupledreceptors,GPCRs)研究領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn).RobertJ.LefkowitzGPCRs研究的奠基人.他開創(chuàng)了利用放射配體研究受體功能的先河,證實(shí)了受體的存在,率先得到受體克隆,發(fā)現(xiàn)了G蛋白偶聯(lián)受體激酶與-arrestins介導(dǎo)受體的減敏與內(nèi)吞,并發(fā)現(xiàn)了-arrestins的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能BrianK.Kobilka多年來(lái)堅(jiān)持不懈,GPCRs晶體學(xué)上的突破性方法,是揭示2腎上腺素受體晶體結(jié)構(gòu)的第一人,GPCRs受體晶體結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展.尤其令人驚嘆的是,他展示了2腎上腺素受體激活瞬間的晶體構(gòu)象.GPCRs的科研經(jīng)歷及成果,希望讀者能夠有所

獎(jiǎng)G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupledreceptors,GPCRs),亦被稱為7次跨膜受體,是一類感受細(xì)胞外信號(hào)分子,激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路并導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)的一類受體大.GPCRs的調(diào)控功能幾乎涉及人體的所有生理過(guò)程,包括交感(腎上腺素受體,adren-ergicreceptors)與副交感膽堿能受體,acetylcholinereceptor)神經(jīng)調(diào)節(jié)以控制血壓心率等自主神經(jīng)功能,視覺(如視紫紅素,rhodopsin)、味覺、嗅覺、行為與

臨超過(guò)50%的用藥都是GPCRs受體的激動(dòng)劑或拮抗劑,包括受體拮抗劑、抗組胺藥和各種精神科用藥 化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了RobertJ.Lefkowitz和BrianK.就是基于他們?cè)贕PCRs研究領(lǐng)域的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)盡管GPCRs種類和功能繁多,但它們信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)理具有極大的相似性.GPCRs與激動(dòng)劑配體結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化,G蛋白上結(jié)合的GDP交換成GTP,從而使G蛋白的亞基與,亞基分離,激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylcyclase,AC)、磷脂酶C(phosph-英文英文格式:XiaoH,ZhangYY.ThediscoveryroadofG-protein-coupledreceptors:introductionoftheNobelPrizewinnersinChemistry2012,RobertJ.LefkowitzandBrianK.Kobilka.SCIENTIASINICAVitae,2012,42:1018–1024, :10.1360/052012-3954242卷12等:G化學(xué)獎(jiǎng)得主等:G化學(xué)獎(jiǎng)得主RobertJ.Lefkowitz和BrianK.olipaseC,PLC)或離子通道等,繼而激活下游的信號(hào)通路,cAMP、甘油二酯(diacylglycerol,DG)、三磷酸肌醇(IP3)和鈣信號(hào)等.這些都已經(jīng)是寫在教科書上的經(jīng)典知識(shí),2060年代末,當(dāng)RobertJ.Lefkowitz開始GPCRs的研究之前,GPCRs尚只是一個(gè)抽象的概念[2],由于缺乏直接的,甚至被許多人懷疑是否存在受體[3,4].當(dāng)時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AC的存在,因此甚至有人認(rèn)為“腎上腺素受體”RobertJ.Lefkowitz的涯始于1968年,在國(guó)立衛(wèi)生(NH)做研究來(lái)履行他的兵役義務(wù)[6].經(jīng)過(guò)14個(gè)月的無(wú)數(shù)次失敗與努力后,他終于取得了初步成果,利用放射性碘標(biāo)記的促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocortioropchormone,ATH)證實(shí)了ATH與腎上腺皮質(zhì)粗制膜上的ACH受體特異性結(jié)合并激活A(yù)C[7].從此,他開創(chuàng)了利用放射性配體研究受體功能的先河[8].直至今天,放射配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)依然是檢測(cè)受體親和性、密度與功能的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方.在NIH的科學(xué)研究工作結(jié)束后,Lefkowitz博士回到麻省總醫(yī)院繼續(xù)做心臟科醫(yī)生,在那里他開始了腎上腺素受體的研究工作[9].1972年,他利用親和色譜法(ffniychromaography)分離出心臟腎上腺素受體蛋白[10].1973年,Lefkowitz博士在Duke大學(xué)擁有了自己的.在那里,他與同事一起首次清楚地證實(shí)了腎上腺素受體和AC是截然不同的兩個(gè)大分子[11].利用放射配體結(jié)合實(shí)驗(yàn),他們發(fā)現(xiàn)受體結(jié)合及活性受GTP調(diào)節(jié),因此提出了受體-GTP結(jié)合蛋白-AC三元復(fù)合模型(ternarycompexmode)[12].接下來(lái),他們分離G蛋白以及AC,并在脂質(zhì)囊泡中重建這一系統(tǒng),決定性地證實(shí)了三元復(fù)合模型理論以及受體的功能特點(diǎn)[13,14].1986年,對(duì)Lefkowitz來(lái)說(shuō)是意義非凡的一年.這一年,他和他的同事們成功克隆出腎上腺素受體(-adrenergicreceptor,AR),這是第一個(gè)被克隆的GPCR[15].與此同時(shí),他們發(fā)現(xiàn)AR與視紫紅質(zhì)(rhodopsin)在結(jié)構(gòu)上相似,G蛋白偶聯(lián)發(fā)揮功能,從而提出了GPCRs可能是個(gè)大,結(jié)構(gòu)上可能都是7次跨膜蛋白[16].這一里程碑式的發(fā)現(xiàn)開啟了現(xiàn)代GPCR信號(hào)通路的研究.Lefkowitz本人都未曾想到,GPCRs800族,而且這個(gè)成員還在繼續(xù)增加.腎上腺素受體的其他亞型隨即也被克隆出來(lái)[17],利用點(diǎn)突

變[18]和嵌合受體(2-,2-adrenergicreceptor)的表達(dá)揭示了受體上特異性的配體結(jié)合區(qū)域與G蛋白偶聯(lián)區(qū)域[19].根據(jù)AR的序列,他們又首次利用雜交技術(shù)得到了第一個(gè)“孤兒受體”(orphanGPCR,即未知配體與功能的GPCR)[20].一年后,他們又證實(shí)這個(gè)受體實(shí)際上是5HT1A受體,這也是第一個(gè)“去孤兒化”受體[21].直到今天,“孤兒受體”的研究依然在為藥物在研究腎上腺素受體功能的過(guò)程中,Lefkowitz的研究小組發(fā)現(xiàn)了GPCR的減敏現(xiàn)象(desensitiza-tion)[22,23].也是在1986年,他們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的激酶,可以磷酸化腎上腺素受體從而介導(dǎo)受體的減敏.這個(gè)激酶被稱為腎上腺素受體激酶(-adrenergicreceptorkinase,ARK)[24].同時(shí),研究視覺的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了視紫紅質(zhì)激酶(rhodopsinkinase),它參與了抑制視紫紅質(zhì)信號(hào)通路.Lefkowitz與他的同事克隆了視紫紅質(zhì)激酶,并發(fā)現(xiàn)它在結(jié)構(gòu)上與ARK非常類似[25],從而聯(lián)想到可能存在一個(gè)GPCRs激酶,現(xiàn)在稱之為G(gprotein-coupledreceptorkinases, .隨后 ,Lefkowitz研究組與其他研究組先后克隆出其他的GRK成員今天人們知道,這個(gè)包括個(gè)成員,稱為GRK1~GRK7,調(diào)節(jié)了所有已知的7次跨膜受體.根據(jù)其結(jié)構(gòu)、功能與組織表達(dá)特性,又分為GRK1,GRK2GRK4三個(gè)亞.其中GRK1亞包括GRK1(視紫紅質(zhì)激酶)和它們分別只表達(dá)在視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞和視椎細(xì)胞.GRK2GRK2(ARK1GRK3(ARK2),它們是廣泛表達(dá)的.GRK4亞包括GK4~GRK6,GRK4和腎臟組織中表達(dá),GRK5GRK6是廣泛表達(dá)的.它們都在結(jié)構(gòu)上高度保守,具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域,包括一個(gè)中心催化區(qū)和兩側(cè)的兩個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)域[26].最近,Lefkowitz和他的同事們又利用蛋白GRKs,(“barcode”hyp-隨著GRKs研究工作的深入,Lefkowitz研究組又發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)調(diào)節(jié)受體功能的蛋白-arrestin.在純化ARK的過(guò)程中,他們發(fā)現(xiàn)純化的ARK雖然能磷酸化受體,但卻失去了“減敏”受體的能力,因此推測(cè)可能存在另一個(gè)調(diào)節(jié)因子[28,29].當(dāng)他們正為此困擾時(shí),另一課題組了被稱為“48Kprotein”或“Sgen”的視網(wǎng)膜蛋白可以與磷酸化的視紫紅質(zhì)結(jié)合從而干擾下游信號(hào)通路[30].LefkowitzARK的減敏能力[28,31].arrestin.隨后,Lefkowitz研究組利用視網(wǎng)膜arrestin克隆,-arrestin1[32]和-arrestin2[33].現(xiàn)在知道,一共有4個(gè)arrestins,arrestin1和arrestin4只表達(dá)在視網(wǎng)膜,arrestin2(-arrestin1)和arrestin3(-arrestin2)則廣泛表達(dá).-arrestin1和-arrestin2通過(guò)阻斷Gs蛋白激活,cAMP合成,參與GRK2的減敏作用.近年來(lái),他們又發(fā)現(xiàn)-arrestins還可以通過(guò)招募磷酸二酯酶phosphodiesse(如PDE4D)到受體并降解第二信使,從而減敏受體信號(hào)通路[34].因此,-arrestinscAMPcAMP降解來(lái)介導(dǎo)受體減敏過(guò)程除了減敏受體,-arrestinsclathrin依賴的胞吞過(guò)程(clathrin-dependentendocytosis)[35他們還發(fā)現(xiàn),介導(dǎo)受體內(nèi)化的胞吞過(guò)程需要-arrestinsE3ubiquitinligaseMDM2泛素化,從而介導(dǎo)受體的降解[36].近年來(lái),他們還發(fā)現(xiàn)-arrestins本身可以作為信號(hào)分子傳導(dǎo)下游信號(hào)通路[37].-arrestins可以結(jié)合并激活c-Src,激活下游MAPkinases(ERK1/2,P38JNK3),還可以激活A(yù)KT,PI3kinase或的其他蛋白,并通過(guò)形成復(fù)雜的網(wǎng)路進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)[38].近期的這些發(fā)現(xiàn)改變了人們對(duì)GPCRs信號(hào)通路的認(rèn)識(shí),-arrestin/GRK系統(tǒng)不僅可以減敏受體信號(hào)通路,其本身同時(shí)還可以介導(dǎo)下游信號(hào)通路,調(diào)節(jié)一系列的細(xì)胞生理功能,包括產(chǎn)生促細(xì)胞生存和抗凋亡的效應(yīng)[37].這一概念了新的藥物開發(fā)模式,即研發(fā)新的配體,只選擇性地激活-arrestin依賴的G蛋白依賴的信號(hào)通路中的一條,而不激活另一條信號(hào)通路.根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)家的說(shuō)法,這種配體被稱為“biasedagonists”.另一方面,這一概念也了新的阻斷劑的研究,即只阻斷G蛋白依賴的信號(hào)通路,而不阻斷-arrestin依賴的促生存抗凋亡的信號(hào)通路.“super-receptorblockers”.這一阻斷劑有望替代現(xiàn)在臨床常用的腎上腺素受體阻斷劑(beta-blockers)和血管緊張素受體阻斷劑(angiotensinreceptorblockersARBs)來(lái)發(fā)揮更特異的縱觀Lefkowitz的研究,幾乎囊括了GPCRs現(xiàn)代研究的每個(gè)重大發(fā)現(xiàn),GPCRs

奠基人毫不為過(guò).他的走出了很多研究GPCRs的優(yōu)秀科學(xué)家,其中就包括此次化學(xué)獎(jiǎng)的另一得主 BrianK.Kobilka.Kobilka加入Lefkowitz后的第一個(gè)課題就是克隆AR并確定其序列[15].當(dāng)時(shí)他們手頭只有一些不完整的受體蛋白序列,與Merk公司已經(jīng)合作了2年都以失敗告終.Kobilka加入后,也利用cDNA克隆的方法嘗試,多次努力后均無(wú)功而返于是,Kobilka做出了一個(gè)大膽的決定,即建立一個(gè)組文庫(kù),AR序列片段相匹配的序列,從而得到完整的序列[15].要知道,這是1986年,而不是人類 組計(jì)劃已經(jīng)完成的今天.Kobilka的決定無(wú)疑是的,但他成功了,很快他們克隆出了AR并得到了完整的序列如前文所述,這是一個(gè)里程碑式的成果.KobilkaGPCRs的研究作為他畢生的追求.生活中的他是個(gè)謙遜、不善言辭甚至害怕社交的人,只有在談到GPCRs時(shí),整個(gè)人才變得生動(dòng)起來(lái),毫不掩飾他對(duì)GPCRs的熱愛[39].Duke大學(xué)后,KobilkaStandford大學(xué)的教職,在那里他開始了GPCRs三維分子結(jié)構(gòu)的研究.XGPCRs的三維結(jié)構(gòu),必須首先得到GPCRs晶體.這是一個(gè)讓眾多科學(xué)家望而卻步的,因?yàn)镚PCRs的幾個(gè)特性讓它極難形成結(jié)晶.首先,GPCRs是膜蛋白,需要將它從膜上完整地分離下來(lái)并結(jié)晶,而恰恰又是細(xì)胞膜才能維持它的立體形態(tài).缺乏極性表面也讓其比水溶性物質(zhì)難結(jié)晶得多;其次,GPCRs在細(xì)胞中的表達(dá)量很低;最后,也是最重要的一點(diǎn),GPCRs極不穩(wěn)定,形態(tài)始終處于變化中,即便沒有外界刺激,受體也是處于活化狀態(tài),傳遞著細(xì)胞外信號(hào)[40].出于對(duì)了解GPCRs分子結(jié)構(gòu)的渴望,Dr.Kobilka在這條艱難地堅(jiān)持了數(shù)十年.在此期間,視紫紅質(zhì)晶體第一個(gè)被純化出來(lái)[41].GPCRs成員不同的是含量豐富且結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,結(jié)構(gòu)并不具有代表性.直到2007年,Dr.KobilkaGPCRs結(jié)構(gòu),并利用反向激動(dòng)劑抑制其基礎(chǔ)活性,最終得到了2AR結(jié)晶.受體第三內(nèi)環(huán)參與G蛋白活化,并GRKs,arrestins和其他信號(hào)分子相互作用,是結(jié)構(gòu)最不穩(wěn)定的區(qū)域(unstructuredregions)[42].其中一個(gè)方法就是在受體第三內(nèi)環(huán)結(jié)合上一個(gè)抗體(Fab5)以穩(wěn)定受體2結(jié)構(gòu),促進(jìn)晶體形成[42].而這一抗體并不影響受體親和能力與構(gòu)象[43];另一個(gè)方法則是將2腎上腺素受體的第三內(nèi)環(huán)區(qū)用一個(gè)T4噬菌體溶菌酶(T4phagelysozyme,T4L)替代,從而穩(wěn)定受體結(jié)構(gòu),促進(jìn)結(jié)晶[44,45].這些研究揭示了AR的晶體結(jié)構(gòu)與視紫紅質(zhì)存在顯著不同,其跨膜區(qū)不是緊密地聚在一起,而是更為開放的結(jié)構(gòu),提2這是一個(gè)突破性的成果,但是Kobilka并沒有止步,他又瞄向了下一個(gè)更具性的目標(biāo).已經(jīng)得到了受體非活化狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu),那么受體被激活情況下的晶體結(jié)構(gòu)又是如何呢?這個(gè)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)無(wú)疑能讓人們對(duì)受體功能的了解上升到更次.然而,受體更不穩(wěn)定,G蛋白活化后也會(huì)立刻離開受體.2011年,Kobilka與他的合作者利用駱駝產(chǎn)生的納米抗體(nanobody)Nb80,替代G蛋白并模擬其功能.他們將高濃度的激動(dòng)劑結(jié)合的2AR重組在磷脂囊泡中,用來(lái)免疫美洲駝.由于駱駝科動(dòng)物產(chǎn)生的抗體缺乏輕鏈,因此比一般的抗體要小得多.在此基礎(chǔ)上,他們合成了納米抗體,即保留完整的抗原結(jié)合區(qū)域,體積只有傳Fab25%.他們發(fā)現(xiàn),這種納米抗體與2AR結(jié)合后,受體與激動(dòng)劑的親和性增加了上百倍,提示它可以模擬Gs功能.利用這個(gè)抗體,他們得到了與激動(dòng)劑結(jié)合的處于活化狀態(tài)的2AR納米抗體復(fù)合物結(jié)晶[46].晶體結(jié)構(gòu)表明,激活的受體第5,6跨膜區(qū)的胞內(nèi)段向外位移,3,7位移[46].同年,T4溶菌酶(T4L)(Nb35)技術(shù),Kobilka與他的合作者終于得到了2AR-Gs復(fù)合物結(jié)晶,

2AR-Gs復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)[47].這項(xiàng)研究向人們呈現(xiàn)了AR被激活并傳導(dǎo)下游信號(hào)時(shí)的構(gòu)象變化.評(píng)審委員會(huì)評(píng)價(jià)他們到了2AR被激活瞬間的構(gòu)象,并盛贊該成果是一個(gè)分子學(xué)上的杰作,是數(shù)十年研究的結(jié)2縱觀兩位科學(xué)家的科研經(jīng)歷,不難發(fā)現(xiàn)他們的一個(gè)共性,那就是對(duì)科學(xué)信念的執(zhí)著與百折不撓的精神.LefkowitzNIH14個(gè)月沒有任何陽(yáng)性結(jié)果時(shí),他沒有放棄;當(dāng)Kobilka致力于GPCRs結(jié)構(gòu)和功能研究多年沒有突破性成果時(shí),他沒有放棄.獎(jiǎng)評(píng)審評(píng)價(jià)他們的工作為“groundbreakingdiscoveries(開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn))”[48],是因?yàn)樗麄冏龅搅藙e人未能做到的事情,究其原因與他們的堅(jiān)持不懈是分不開的.Lefkowitz在獎(jiǎng)公布后的一次采訪中曾說(shuō)“像很多科學(xué)領(lǐng)域的研究一樣,GPCRs研究工作是長(zhǎng)期而費(fèi)時(shí)并需要獻(xiàn)身精神的,例如你需要花好幾年分離這些受體,然后很多年取得受體克隆,Kobilka10~15年的時(shí)間才得到這些受體的晶體,這是非常的”[49].是的,這是常人難以,但是他們堅(jiān)持了下來(lái),并最終獲得了2本文綜述了RobertJ.Lefkowitz和BrianK.Kobilka兩位獎(jiǎng)得主的科研經(jīng)歷,希望讀者能從中有所借鑒及思考.“Scienceis99percentfailure,andthat'sanoptimisticview”—LefkowitzDuke大學(xué)校長(zhǎng)一次公開談話中的一句話無(wú)疑是對(duì)科研工作的最好注釋[50].科研工作中失敗是很常見的,如何從失敗中學(xué)習(xí)并尋找下一個(gè)突破口才是最關(guān)鍵的.而每一份成功與榮耀的背后,必然都是數(shù)不清的日夜辛勞、失敗與堅(jiān)持,并如此反復(fù)循環(huán)的結(jié)果.TheNobelPrizeinChemistry2012-PopularInformation.14Oct2012,http://LangleyJN.Onthereactionofcellsandofnerve-endingstocertainpoisons,chieflyasregardsthereactionofstriatedmuscletonicotineandtocurari.JPhysiol,1905,33:374–413DaleH.Modesofdrugaction.Generalintroductoryaddress.TransFaradaySoc,1943,39:319b–322b,: 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