核酸印跡與分子雜交

分子生物學(xué)技術(shù)

高穎gaoying822@

核酸印跡技術(shù)與分子雜交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization

核酸分子雜交（nucleotidemolecularhybridization）以DNA的變性、復(fù)性為理論基礎(chǔ)；指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則經(jīng)過(guò)復(fù)性處理后，形成異源雙鏈的過(guò)程。

Southern印跡（Southernblot）基本操作過(guò)程待測(cè)DNA樣品制備、基因探針標(biāo)記；待測(cè)DNA樣品的電泳分離；電泳分離的DNA經(jīng)變性、轉(zhuǎn)移、固定到合適的固相支持物；特異性核酸探針與膜上DNA片段雜交，放射自顯影或顯色檢測(cè)目的DNA的存在。

Southernblot基本流程電泳 轉(zhuǎn)移雜交，顯影酶切DNA樣品上樣 DNA印跡重物Southern

blot關(guān)鍵步驟

待測(cè)DNA樣品的酶切消化基因組DNA進(jìn)行消化，才能在電泳過(guò)程中將不同長(zhǎng)短的DNA片段分離開(kāi)。

基因探針的標(biāo)記

探針序列和探針信號(hào)的選擇。要考慮特定基因的重復(fù)性、保守性和穩(wěn)定性。可用同位素和非同位素標(biāo)記。

Northern印跡（Northernblot）是將RNA從凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，定性分析mRNA的常用方法。注意事項(xiàng)：RNA易被酶降解?？捎糜诜治龌蜣D(zhuǎn)錄水平的變化。Westernblot（蛋白免疫印跡）技術(shù)

是將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠中轉(zhuǎn)印到化學(xué)合成膜的支撐物上，利用特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)，定性分析蛋白質(zhì)。

用于分析基因表達(dá)(蛋白水平）的變化。原位分子雜交技術(shù)利用分子雜交技術(shù)來(lái)進(jìn)行基因及其表達(dá)產(chǎn)物定位分析的一種技術(shù)。

組織、細(xì)胞或染色體的固定；探針；與探針結(jié)合的標(biāo)記物；

可用于基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定位分析。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReaction

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是一種在體外特異地?cái)U(kuò)增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；1999年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?？捎糜诜治龌蚣捌洚a(chǎn)物的水平變化；可進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量分析；

PCR體系模板引物耐熱DNA聚合酶dNTPs含Mg2+的緩沖液

PCR的過(guò)程變性(Denaturing)

95℃DNA模板變性成為單鏈，引物自身和引物間的局部雙鏈消除退火(Annealing)

引物與模板DNA雜交，Tm值減5℃延伸(Extension)

DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成ingPCR技術(shù)的工作原理17PC借R技術(shù)PC兵R分析灰已知講基因遠(yuǎn)；反轉(zhuǎn)罷錄PC差R（re館ve謝rs歲e趴tr磁an泛sc選ri崇pt華io豆n隔PC捷R，RT翅-P賢CR）是將RN置A的反歪轉(zhuǎn)錄餅和PC晚R聯(lián)合切應(yīng)用征的一堵種技燒術(shù)。RT牽-P憐CR是從涂組織把或細(xì)籃胞中烤獲得梯目的蛙基因甚及對(duì)畫(huà)已知陷序列墨的RN盞A進(jìn)行黑定性代及半弦定量諒分析進(jìn)的有脖效方偽法。RT協(xié)-P渡CR與PC延R區(qū)別模板少為mR扇NA需逆拜轉(zhuǎn)錄蠶酶產(chǎn)物部為cD喚NA19mRNA5AAAAAA(n)3mRNA5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5mRNA5cDNA3AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5oligo(dT)12-18反轉(zhuǎn)錄酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3cDNATTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5反轉(zhuǎn)桶錄合睡成cD訓(xùn)NA實(shí)時(shí)損、定香量PC立R技術(shù)在PC揪R反應(yīng)漁體系浙中加迷入熒光沙基團(tuán)，利璃用熒日光信執(zhí)號(hào)積每累實(shí)谷時(shí)檢都測(cè)整屆個(gè)PC陽(yáng)R進(jìn)程曠。通辛過(guò)標(biāo)猛準(zhǔn)曲桿線對(duì)僚樣品堪中的DN陷A的起千始濃深度進(jìn)予行定衡量的御方法午。特點(diǎn)掉：對(duì)DN忽A/奇RN怖A模板葵定量姿，靈策敏度代強(qiáng)，怕特異臭性高姻。21實(shí)時(shí)嫁、定懶量PC乳R技術(shù)QR3'3'5'5'上游居引物下游裹引物熒光蝦標(biāo)記干引物RQ3'3'5'5'DN煮A序列醉測(cè)定DN包A盼Se范qu劈燕en劍ci承ngDN攔A序列塌分析頃方法雙脫耍氧鏈匯終止洗法利用2′，3省′-雙脫非氧核綢苷酸閉摻入勻中，終止媽化學(xué)焰反應(yīng)化學(xué)紐奉裂解切法利用乞化學(xué)胃試劑巧裂解服修飾曬堿基招終止聚桌合反騎應(yīng)戊羊糖（RNA）1′2′3′4′5′核糖(ribose)（DNA）脫氧核糖(deoxyribose)DN罪A的序胃列測(cè)濤定5′端3′端CGA26雙脫州氧鏈雁終止題法dADN以A自動(dòng)浸測(cè)序用不注同熒光充分子箏標(biāo)記局四種節(jié)雙脫即氧核農(nóng)苷酸，然蝕后進(jìn)主行Sa纏ng胖er測(cè)序被反應(yīng)出，反索應(yīng)產(chǎn)寨物經(jīng)性電泳防分離漏后，巨通過(guò)蠅四種披激光酷激發(fā)個(gè)不同柜大小DN膜A片段控上的寇熒光淺分子獲使之潑發(fā)射炎出四貢種不妖同波哲長(zhǎng)熒疫光，聲檢測(cè)宜器采尾集熒裁光信圣號(hào)，甩并依牲此確江定DN繼A堿基篩的排建列順辭序。DN滲A序列鮮自動(dòng)療分析dd貿(mào)G紅dd叼Tdd舉A綠dd導(dǎo)C藍(lán)橙毛細(xì)墊管電雅泳熒光由標(biāo)記DN憤A合成測(cè)序眼結(jié)果撕展示DN木A自動(dòng)愈測(cè)序化結(jié)果嫁舉例DN櫻A序列堡分析纏可以抄揭示債基因太和基因測(cè)組一級(jí)飄結(jié)構(gòu)變化通過(guò)DN泊A序列下分析酸可以車(chē)鑒定區(qū)基因澡和基可因組采的變?cè)挳愅ㄟ^(guò)DN賠A序列檢測(cè)定里分析拴人工腫重組魚(yú)的基燙因通過(guò)DN景A序列本測(cè)定鼠對(duì)定后點(diǎn)突筍變進(jìn)葛行確柜認(rèn)DN墾A芯片職技術(shù)DN期A范Ch有ip何T左ec嚼hn乳ol佩og賀ie婆sDN醉A芯片（DN莫A沉ch信ip）也稱(chēng)DN芝A微陣執(zhí)列(D葡NAmi匪cr練oa螺rr勤ay)在固妻相支傾持物下上有翠序固貧化寡狂核苷藝酸或DN黑A探針開(kāi)，與傲待測(cè)從熒光趟標(biāo)記恭樣品鄙進(jìn)行肚雜交烤；通過(guò)好對(duì)雜亮交信渣號(hào)的勵(lì)檢測(cè)強(qiáng)、比層較和澡分析肅，得憂(yōu)出樣嗚品的進(jìn)遺傳諒信息運(yùn)；包括cD睡NA芯片秀和寡剪核苷燃酸微侍陣列基因賺芯片府工作傭流程DN掛A芯片裁技術(shù)cD訊NA芯片探針軋是cD臭NA片段胡，可旺以同濱任何預(yù)具有扎同源細(xì)序列章的樣泥品形筑成雜旬交體封，同吐時(shí)定捎量監(jiān)逢測(cè)大貍量基脫因的鍬表達(dá)誘。寡核役苷酸砍芯片基因哨特異鞋的寡影核苷冤酸片欠段為探探針窗，對(duì)胡低豐肝度基陸因表民達(dá)水裕平變替化的狗檢測(cè)抖具有便高度雙靈敏任性?？蛇M(jìn)因行高負(fù)通量員基因男轉(zhuǎn)錄石活性移的分倚析DN要A芯片協(xié)技術(shù)筐的特帶點(diǎn)快速、高效、敏感、平行絹化、自動(dòng)立化。通過(guò)檔芯片伐技術(shù)同篩選緞得到束的表造達(dá)信散息還燒要用Nor芽th蝕er朱n數(shù)bl墾ot或定水量RT激-P俯CR進(jìn)行易驗(yàn)證DN陶A芯片眼技術(shù)臂的應(yīng)化用腫瘤爆基因努表達(dá)邁譜的拒差異繞研究適；基因芒多態(tài)何性分頸析；微生鋤物篩稅選鑒丸定；遺傳早病產(chǎn)峽前診膝斷等蛋白俊質(zhì)芯疏片和幫組織跟芯片蛋白套質(zhì)芯倉(cāng)片蛋白歇質(zhì)檢售測(cè)芯群片蛋白車(chē)質(zhì)功辦能芯批片組織姨芯片是以柔形態(tài)沙學(xué)為暗基礎(chǔ)育進(jìn)行學(xué)高通椅量檢撞測(cè)基誦因表圓達(dá)信埋息的零芯片捕技術(shù)蛋白藏質(zhì)芯湖片技術(shù)獄優(yōu)勢(shì)在蛋脊白質(zhì)村結(jié)構(gòu)、功能岔和相響互作筑用，收以及疾病衫發(fā)展丘過(guò)程件中蛋溪白表艘達(dá)譜坐差異錄研究旋等方面。在臨要床醫(yī)撈學(xué)研錫究中從，利阻用蛋攻白質(zhì)變芯片柱技術(shù)尋撕找新咳的腫瘤泰標(biāo)記蹈物，各霸種