蛋白質沉淀技術

蛋白質沉淀技術一、蛋白質的基本性質蛋白質是人體機能構成成分,人體任何器官和組織都是以蛋白質作為重要組成成分。鑒于蛋白質重要性研究蛋白質分離十分必要。1、膠體性質蛋白質表面有一些親水基團易起水合作用，從而形成水化層，導致蛋白質顆粒不易聚集沉淀，這些蛋白質分子直徑在2～20nm范圍，所以蛋白質溶液是親水膠體，具有半通透性，丁達爾效應、布朗運動等一些親水膠體性質①

。[1]楊豐科.系統(tǒng)有機化學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003·433一435.2、兩性解離和等電點蛋白質可解離基團包括末端α-氨基和末端α-羧基及可解離側鏈R基。這些可解離基團在特定的PH范圍內(nèi)解離，產(chǎn)生帶正電荷或者帶負電荷的基團。當溶液PH使蛋白質所帶正電荷與負電荷恰好相等，即蛋白質分子本身凈電荷為零，此時PH即為該蛋白質分子等電點，用PI表示，測PI時一定在緩沖液中進行，因為離子強度可以使PI改變①。[1]楊豐科.系統(tǒng)有機化學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003·433一435.兩性解離和等電點3、沉淀作用沉淀是指在溶液中加入沉淀劑使溶質溶解度降低，形成固相從溶液中析出從而達到分離的一種技術。沉淀分離方法和其他分離方法相比，優(yōu)點是過程簡單、成本低、原料易得，便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺點為過濾困難、產(chǎn)品質量較低，需重新精制。4、變性作用天然蛋白質受物理或化學因素影響，蛋白質分子內(nèi)部維系其高級結構原有氫鍵、鹽鍵等次級鍵遭到破壞，使分子內(nèi)部結構發(fā)生改變，導致其生物學性質、物理化學性質改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質變性作用。5、凝固作用變性蛋白質分子相互凝聚或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象稱為蛋白質凝固，例如生雞蛋蛋白溶液受熱變?yōu)榈鞍讐K現(xiàn)象。6、顏色反應蛋白質顏色反應實際上是氨基酸一些基團肽鍵等與一定試劑所產(chǎn)生化學反應。二、蛋白質沉淀分離技術蛋白質膠粒上同性電荷互相排斥，不易凝聚成團下沉；蛋白質表面許多親水基團水合作用形成一層水化膜,在膠粒之間起隔離作用，蛋白質在水溶液中,雖分子量很大,但仍能維持穩(wěn)定溶解狀態(tài)。若能除去其水化膜并中和其電荷,則蛋白質可從溶液中沉淀而出。常用有以下幾種沉淀方法：蛋白質沉淀分離常用方法1、鹽析法2、有機溶劑沉淀法3、等電點沉淀法4、變性沉淀分離技術5、復合鹽沉淀法1、鹽析法（中性鹽沉淀）

一般來說,所有固體溶質都可在溶液中加入中性鹽而沉淀析出,這一過程稱之鹽析②。（1）中性鹽沉淀蛋白質的基本原理

a.高濃度鹽離子使蛋白質表面雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱。b.中性鹽比蛋白質具更強的親水性，因此將與蛋白質爭奪水分子。[2]李冬梅,張錦茹,田園.蛋白質沉淀分離[J].糧食與油脂,2007·9一11鹽析法鹽析機理示意圖鹽析法（2）中性鹽的選擇原則a.要有較強的鹽析效果。一般來說，陰離子影響鹽析的效果比陽離子顯著，且含高價陽離子的無機鹽比含低價陽離子的無機鹽效果好。b.要有足夠大的溶解度，且溶解度受溫度影響盡可能地小。便于獲得高濃度的鹽溶液，尤其是在低溫時，不至于造成鹽結晶的析出。c.不影響蛋白質等生物大分子的活性，并且，最好不引入給分離或測定帶來麻煩的雜質。d.來源豐富，價格低廉。鹽析法常用的中性鹽有：(NH4)2SO4

，Na2SO4，NaH2PO4等。其中最重要的是(NH4)2SO4。優(yōu)點：①溶解度大；尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度②分離效果好；③有穩(wěn)定蛋白質結構的作用，不易引起變性；④價格便宜；廢液可以肥田，不污染環(huán)境。缺點：硫酸銨水解后變酸，在高pH值下會釋放出氨，腐蝕性較強，因此，鹽析后要將硫酸銨從產(chǎn)品中除去。鹽析挨法（3）影翁響鹽型析的丑因素a.蛋白憤質濃概度一般刻較適貞當?shù)拿悠肥碀舛雀闶?.應5%豪-3宅.0偏%，通佩過實靈驗確博定。b.離子聞強度顫和類殃型一般走來說,離子程強度津越大,蛋白危質溶秤解度陰越低跟。下面姐為幾丸種鹽翻鹽析棟能力呼排列鴿次序:磷酸揉鉀>硫酸計鈉>磷酸血銨>檸檬橡酸鈉>硫酸鍛鎂③[3雁]Ge晉la釋zk渡aV哲B升,S者mi站th姻D不D遮S捉,Le行dw灰ar勿dD饒A攀,e必t仙al架.豆In銹fl脆ue輕nc猛e專of玻h灶ig恩h稅pr稼es榆su崇re每o法n兆pr王ot炸ei挎n-糟po飽ly造sa鄉(xiāng)豐cc南ha瓜ri樣dein辯te牲ra蜂ct謠io屯ns噴[J]膽.Pr辰os危.I傾nt給.C藥on晚f,1香99災8,污24顏:3損97詳-4炎00賴.鹽析笛法c.葵pH值一般培來說,蛋白延質所巷帶凈東電荷猾越多,溶解捧度越破大；宣凈電寶荷越則少,溶解盞度越變小,在等片電點景時蛋邪白質乞溶解榨度最疾小,為提投高鹽忽析效妨率,多將混溶液pH值調員到目婦的蛋彈白等抖電點暈處。d.溫度在低傭離子份強度舟或純傍水中,蛋白圍質溶清解度陶在一寫定范趣圍內(nèi)儉隨溫頃度增趙加而巖增加;但在分高濃業(yè)度下,蛋白括質、敢酶和潮多肚姓類物坑質溶尼解度錦隨溫搏度上備升而救下降膚。在最一般宗情況霜下,蛋白觀質對模鹽析快溫度浴無特爬殊要摔求,可在漠室溫耽下進等行,只有嗎某些套對溫晉度較房誠敏感流酶要省求在0℃～4℃進行太。鹽析棟法（4）脫騎鹽常用抖的脫螞鹽處貨理方口法有萄：透今析法浙、超畜濾及軟凝膠脖過濾小法。透析最早天應用康的膜頑分離瞎技術算。2、有拆機溶拖劑沉往淀法（1）有尊機溶述劑沉肥淀機垮理：降低念水的毀介電敏常數(shù),導致吃具有歇表面門水層膀的生錢物大銀分子本脫水,相互漸聚集,最后傾析出摘。該法優(yōu)點在于：a.分辨睛能力它比鹽答析法悶高,即蛋使白質挺只在捉一個選較窄疏有機茂溶劑倒?jié)舛却鲁劣鸬?b提.沉淀喬不用捆脫鹽嗓，過絮濾較剛為容界易。其缺點是對顫具有窯生物分活性胖大分逢子易艷引起謙變性爺失活,操作葉要求栗在低界溫下之進行礎?？傮w賠來說,有機爪溶劑隨沉淀院法不贈如鹽刮析法喬普遍②。[2慎]李冬宴梅,張錦憤茹,田穩(wěn)園.蛋白源質沉糾淀分縱離[J反].糧食糠與油問脂,2箭00嶺7·架9一11有機耐溶劑速沉淀伶法(2借)有機妻沉淀或劑有機繳沉淀奇劑有桿乙醇殃、甲神醇、拿丙酮書、二考甲基始甲酰挨胺、滅二甲嗎基亞谷砜、煌異丙挽酮等,其中回最常成用的趁是乙徹醇和笨丙酮袖。蛋妻白質仍和酶穴的沉扣淀大熄多采延用乙恒醇,由于戴甲醇域、丙猜酮均綠有一客定毒愿性,故使挺用時些必須妹謹慎渣。有機那溶劑幼沉淀砌法(3番)有機榨沉淀澆劑分障離技吵術的田影響盜因素溫度低溫，而且要保持溫度的相對恒定。樣品濃度蛋白質:0.5%-2%;黏多糖1%-2%pH保證待沉淀物穩(wěn)定的前提下，接近等電點離子強度重要因素，一般以0.01mol/L-0.05mol/L為宜金屬離子鈣離子、鋅離子等，可與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質形成復合物有機鍋溶劑踩沉淀夜法(4崗)應用僅實例應用鴿實例靠有高成粱蛋撕白質挪的提蕩取,其基斑本工桃藝流們程為:高梁旨粉→可萃取血→離果心→褲沉淀筐→水鹽洗→盯烘干[4攝][4簡]張偉盡敏,譚小漫蓉,鐘爸耕.高粱循蛋白搜質研巾究進惠展[J能].糧食酸與油仙脂,2滅00透5(嫌1)猴:7廢-衣9.3、等織電點押沉淀薪法（1）等纖電點駝沉淀赤法的胳原理等電熱點(pI)是兩各性物誰質在芬其質新點的毅凈電麗荷為嬸零時湯介質螺的pH值,溶質恒凈電核荷為瓶零，趨分子子間排貫斥電滴位降漂低，把吸引獵力增像大，旅能相紐奉互聚武集起哲來，揭沉淀睬析出邊，此狂時溶腰質的夏溶解旁度最廣低。等電送點沉騎淀法（2）等好電點課沉淀眉法的剖影響事因素a.雜質厘種類娃的影信響混合岔液中歷存在鉛許多到等電肺點相龍近的甜兩性煩電解址質，季單獨詳使用任此法浮效果脅差。b.離子西強度照的影航響蛋白眼質有奴鹽溶民和鹽煎析兩辦面性耗，等庫電點夢的數(shù)沃值隨握著溶壘液中刮中性琴鹽離向子的烘種類苦和濃言度變滲化而累變化敲，所地以離傾子強藍度對致等電確點的干沉淀配作用挎影響億較大碧。c.溶質廁表面條極性茅的影關響等電凳點沉間淀法場適合紫于疏澇水性賭較大寨的蛋兵白質倦（如誤酪蛋卸白）偷，因傷其表奇面水牲化層辜相對暢較薄執(zhí)。而透親水容性較量強的填蛋白弦質在倚等電戶點下封不容鼻易產(chǎn)避生沉垮淀，拼這時需要桌結合延其他傅方法裂一起恢使用市。等電曾點沉惱淀法(3聚)應用編實例應用亮實例還有大犧豆蛋丑白的伯堿饑提酸稿沉法,基本令工藝棄流程切為:豆粕乒原料厭→二誓次堿偏提→占粗濾疼→酸萌沉→譽打漿管→回僑調→嗓改性忘→噴決粉→幻玉成品[5醬][5酒]高孔縫榮,黃惠部華,梁照賄為.食品鍵分離業(yè)技術[歪M巧]烈.廣州:華南咽理工棚大學界出版予社,宮19憐98居:易12畫-棍15驅.4、變藍性沉兆淀分已離技郵術（1）基醋本原罩理利用醫(yī)生物否大分護子物乎質對攪物理屋、化平學等姐外部挺環(huán)境使因子紙敏感哥性的記差異放而選冒擇性電地使牽一種糖組分剖發(fā)生浩變性續(xù)形成悼沉淀,而另查一些瓣組分晌保持姨不變,從而鄉(xiāng)豐達到殘分離議、除產(chǎn)雜和決提純詠的目托的。變性雕沉淀孟分離罪技術（2）變望性沉抱淀分旗離的凝方法a.熱變辛性沉俗淀分努離:利用拐蛋白兩質熱棍穩(wěn)定沿性不皆同的妙特點,使蛋吩白質耳組分虹之間溉得以抽分離,同時卷使蛋厲白質賀與水凱及其栽他可良溶物扮分離,此法身常用爹于組堂織化裂植物常蛋白娃的生誦產(chǎn)[6男]。[6概]張建鋒云,邱搜堅,李正閘紅,等.木豆蒙葉蛋溫白提哈取工啄藝研禮究[J柏]燙.西南厘林學魯院學乓報,絡20杯01響,采21愚(列1)慚:激4隊0-虹4為4.變性垮沉淀存分離賞技術b.選擇疏性酸捉堿變海性沉置淀分宮離:利用跑酸堿裳變性釣原理,通過財調節(jié)針溶液pH值,可有泳選擇騾地去關除雜主蛋白,常用應于生顆化制完備中[7晉]。c.利用蠟酶進咱行變轟性分悼離:利用柔酶的士催化斬作用追使一行些蛋費白質銀變性,從而蝕沉淀冰分離,如凝鮮乳酶逢催化棗牛乳太酪蛋梅白的見沉淀宴。[7呈]劉氣芳,敖常膜偉.刺槐撞葉蛋簡白提狗取工暢藝條怠件的洗初步鴉研究[J邁]螞.中南費林學耐院學側報,他19軟99搞,更19夠(愁1)限:跳6嬌4-葬6凱7.變性今沉淀類分離脂技術d.利用仙表面躺活性丘劑或著有機沖溶劑望引起仆變性梢沉淀肌分離:在制耍備核賀酸時,可加義入含狠水酚聞、氯澆仿以績及十男二烷擋基磺奪酸鈉她等試即劑,有選忌擇地澡使蛋恭白質煮發(fā)生賽變性趙沉淀,達到忠去除磁雜質薄、提展純核細酸的苦目的祖。變性霞沉淀蛾分離勺技術(3奴)影響漏蛋白直質變火性的令因素a.溫度秀。在較箱高溫效度作昏用下,蛋白蝕質的垮二級紫、三昂級和般四級蛋結構守的弱僅鍵斷年裂,破壞耳了肽活鏈原欠來特鬼有的臣排列東和空著間結額構,使原殲來在顏大分減子內(nèi)械部的施極性撐基團泉轉到末分子勉表面,促進亦蛋白匙質分勾子相獎互凝貝集而遙沉淀,但溫餓度過即高又朋會使添蛋白起質發(fā)患生變把性。變性治沉淀千分離流技術b.充pH值。大部值分蛋李白質簡在pH現(xiàn)4～10的范框圍內(nèi)水是比蒸較穩(wěn)仁定的,超過底這個滋范圍癢強酸韻或強浪堿會新使蛋根白質嶼分子努內(nèi)的盤基團姥帶電腔性質士發(fā)生糕變化,從而此破壞飲靜電遙引力在所形蠢成的彈鍵,使原骨來的腔構象窩發(fā)生宜變化,導致扭蛋白姑質變病性c.其他慢化學洗因子舒。5、鹽輪復合得物沉姥淀法a.金屬財復合炮鹽法:許多秀有機笨物質飾包括面蛋白替質在取內(nèi),在堿吵性溶除液中孝帶負糧電荷,能與滾金屬膽離子雖形成京沉淀漁。根境據(jù)有切機物較與它摟們之浪間作辱用機微制,可分誤為羧卸酸、敢胺及鬼雜環(huán)病等含江氮化忌合物,如銅餅、鋅贊、鍋;親羧繁酸疏返含氮然化合邊物類,如鈣籌、鎂助、鉛;親硫才氫基?；蠣幬镱?如汞居、銀耽、鉛成等。庸蛋錄白質激一金指屬離