亞細胞蛋白質(zhì)組學

亞細胞蛋白質(zhì)組學1第一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)概論

真核生物體是一個復雜系統(tǒng)。

蛋白質(zhì)的亞細胞定位對蛋白質(zhì)生物功能的發(fā)揮起到極關鍵的作用，蛋白質(zhì)亞細胞定位信息強烈暗示著其生物學功能。

亞細胞蛋白組學已日益成為蛋白質(zhì)組學研究的焦點之一。

——RabilloudT,KiefferS,ProcaccioVetal.Electrophoresis,1998,19:1006-14.

以人為例，基因組分析表明，人具有3萬~5萬個基因，經(jīng)過剪切和翻譯后修飾產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)種類；受蛋白質(zhì)等電點極限、疏水性、相對分子質(zhì)量范圍以及蛋白質(zhì)豐度限制，很難由2-DE技術一步到位地獲得生物體的全蛋白質(zhì)組。2第二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、亞細胞蛋白質(zhì)組學的內(nèi)涵

亞細胞蛋白質(zhì)組學(subcellularprote-omics)：針對細胞內(nèi)不同區(qū)域結(jié)構(gòu)功能單位的蛋白質(zhì)組學研究。3第三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、亞細胞蛋白質(zhì)組學的內(nèi)涵細胞器(organelle)或細胞區(qū)域

如細胞膜(cellmembrane)、細胞漿(cytoplasm)、線粒體(mitochondria)、溶酶體(lysosome)、過氧化物酶體(peroxisome)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum)、高爾基體(golgiosome)和細胞核(cellnucleus)等。4第四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五大分子結(jié)構(gòu)體(macromolecularstructure)或多蛋白質(zhì)復合體(multiproteincomplex)如核基質(zhì)(nuclearmatrix)、剪接體(spliceosome)、紡錘體(spindlepole)、核孔結(jié)構(gòu)(nuclearporecomplex)以及核糖體(ribosome)等。一、亞細胞蛋白質(zhì)組學的內(nèi)涵5第五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五富集低豐度蛋白質(zhì)，完善全細胞蛋白質(zhì)組提供蛋白質(zhì)的亞細胞定位信息加深對亞細胞組分的結(jié)構(gòu)功能理解加深對細胞生理分子機制的理解利于亞細胞蛋白質(zhì)組的差異表達譜研究二、亞細胞蛋白質(zhì)組學的意義6第六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五三、亞細胞蛋白質(zhì)組學的技術基礎（一）亞細胞組分的分離（二）蛋白質(zhì)組學技術（三）蛋白質(zhì)亞細胞定位實驗技術（四）蛋白質(zhì)亞細胞定位預測技術亞細胞組分的分離純化蛋白質(zhì)組學技術研究7第七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五（一）亞細胞組分的分離亞細胞分級細胞的破碎亞細胞組分的分步分離免疫共沉淀分離信號復合體親和層析法分離不同親和特性的亞細胞組分分離純化效果評價8第八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五1、細胞的破碎：滲透壓沖擊、超聲波震蕩、機械力研磨或剪切（一）亞細胞組分的分離2、亞細胞組分的分步分離

差速離心

與密度梯度離心

聯(lián)用

9第九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五

差速離心(differentialcentrifugation)

是利用樣品中各種組分的沉降系數(shù)不同而進行分離的方法，又稱差分離心或差級離心。通常兩個組分的沉降系數(shù)差在10倍以上時可以用此法分離。10第十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五優(yōu)點：樣品處理量較大，可用于大量樣品的初級分離。缺點：分離復雜樣品和要求分離純度要求較高時，離心次數(shù)太多，操作繁雜。11第十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五差速離心形成的沉淀（肝臟）沉淀RCF(gav)×時間內(nèi)容物P11000g×10min細胞核，重線粒體，大片細胞膜P23000g×10min重線粒體，細胞膜碎片P36000g×10min線粒體，溶酶體，過氧化物酶體，完整高爾基體P410000g×10min線粒體，溶酶體，過氧化物酶體，高爾基體P520000g×10min溶酶體，過氧化物酶體，高爾基體膜，大的高密度小泡（如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）P6100000g×10min從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而來的所有小泡，細胞膜，高爾基體，核內(nèi)體等例注：RCF即相對離心力。12第十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五細胞器的大小和沉降特性亞細胞成分大小/μmRCF/g時間/min細胞核4~12500~10005~10核膜*2000(30000)30(5)線粒體0.4~2.51000~1000010~15溶酶體0.4~0.86000~1500010~20過氧化物酶體0.4~0.86000~1500010~20粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡0.05~0.3530000~10000030~60光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡0.05~0.350000~10000030~60胞膜

大片3~201000~300010~15

小泡0.05~2.050000~10000030~60核內(nèi)體0.05~0.450000~10000030~60高爾基體(完整)1.0~2.010000~2000020~30高爾基體(小泡)0.05~0.550000~10000020~40肌質(zhì)網(wǎng)0.1~1.010000~3500020葉綠體2~51000~200010植物線粒體1~35000~2000015*

核膜的制備物是否是完整的包膜，它的沉降速率取決于制備的方式。13第十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五

密度梯度離心(isodensitycentrifugation)

又稱為區(qū)帶離心，是將樣品溶液置于一個由梯度材料形成的密度梯度液體柱中，離心后被分離組分以區(qū)帶層分布于梯度柱中。按照離心分離原理，梯度離心又可分為速率區(qū)帶離心法(又稱連續(xù)密度梯度離心法)和等密度離心法(又稱不連續(xù)密度梯度離心法)。14第十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五

速率區(qū)帶離心法是根據(jù)樣品中不同組分粒子所具有的不同體積尺寸大小和不同沉降系數(shù)進行分離。

等密度區(qū)帶離心法是根據(jù)樣品組分的密度差別進行分離純化。15第十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五密度梯度離心介質(zhì)

蔗糖梯度便宜，溶解度高，能夠制備分離絕大多數(shù)成分所要求的密度范圍的溶液，最常用；高濃度時黏性大，且滲透壓高。

FicollNycodenzPercollMetrizoate16第十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五亞細胞成分在蔗糖和低滲透壓介質(zhì)中的密度亞細胞成分密度/（g·cm-3）蔗糖低滲透壓介質(zhì)*細胞核>1.301.21~1.24核膜1.18~1.22n.a.線粒體1.17~1.211.15~1.20Mitoplast線粒體質(zhì)1.44n.a.溶酶體1.19~1.211.10~1.15過氧化物酶體1.18~1.231.19~1.22粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)1.18~1.26n.a.光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)1.06~1.151.03~1.07細胞膜

大片1.14~1.191.12~1.15

小片1.07~1.161.05~1.12核內(nèi)體1.06~1.161.05~1.10高爾基體（完整）1.05~1.121.03~1.08高爾基體（小泡）1.05~1.121.03~1.08肌質(zhì)網(wǎng)1.04~1.08n.a.葉綠體1.18~1201.10~1.13植物線粒體1.16~1.19n.a.注：n.a.為未得到數(shù)據(jù)；*這些數(shù)據(jù)是在Nycodenz、Metrizoate或Percoll中的密度。17第十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五3、免疫共沉淀法(Co-IP)分離信號復合體

(Signalingcomplex)

（一）亞細胞組分的分離18第十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五（一）亞細胞組分的分離4、親和層析法分離不同親和特性的亞細胞組分

根據(jù)細胞或亞細胞組分中不同種類的翻譯后修飾特性可望用來分離各類被修飾的蛋白質(zhì)。19第十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五（一）亞細胞組分的分離5、分離純化效果的評價

判斷亞細胞分離純化是否成功，可以用光學或電子顯微鏡監(jiān)測，或者檢測蛋白質(zhì)濃度或合適的標志酶。

純化過程中跟蹤合適的標志酶的活性可以確定目的細胞器的產(chǎn)率和污染其他細胞器成分的程度。通過在純化過程中確定蛋白質(zhì)的濃度，計算每一步的比活性（活性與蛋白質(zhì)的比率），可以用來估算富集程度或純化倍數(shù)。20第二十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五哺乳動物細胞膜的主要酶分布特點膜成分酶細胞膜

頂端膜5’-核苷酸酶、亮氨酸氨肽酶、堿性磷酸酶

基底膜Na+/K+-ATP酶、激素控制的腺苷酸環(huán)化酶通用5’-核苷酸酶、Na+/K+-ATP酶線粒體琥珀酸脫氫酶溶酶體Β-半乳糖苷酶、酸性磷酸化酶、芳基硫酸酯酶過氧化物酶體過氧化氫酶、尿酸酶高爾基體半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)NADPH(或NADH-)細胞色素c還原酶核膜核苷酸三磷酸酶線粒體外膜單胺氧化酶線粒體內(nèi)膜細胞色素氧化酶21第二十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五（二）蛋白質(zhì)組學技術傳統(tǒng)2D-MS1D或LC+MS2D-LC-MS/MS蛋白質(zhì)分離技術與蛋白質(zhì)鑒定技術的結(jié)合22第二十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五（三）蛋白質(zhì)亞細胞定位實驗技術endoG-YFP

(apoptoticendonuclease)MitochondriaCo-localization

為了驗證亞細胞蛋白質(zhì)組學的研究結(jié)果，如新發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的亞細胞定位及其在亞細胞結(jié)構(gòu)中的可能功能，需要細胞或分子生物學的補充實驗予以證實。WesternblotTAP(tandemaffinitypurification)電鏡技術熒光顯微鏡技術23第二十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五（四）蛋白質(zhì)亞細胞定位預測技術

亞細胞定位預測主要基于蛋白質(zhì)氨基酸序列的三個方面的特性：氨基酸組成特點、分揀信號的識別以及氨基酸序列的進化保守性。

蛋白質(zhì)在胞漿合成后，須在N端分揀信號(sortingsignal)

的指引下到達不同亞細胞部位發(fā)揮生物學功能。常用于蛋白質(zhì)亞細胞預測的各種分揀信號包括：信號肽(signalpeptide,SP)、線粒體引導肽(mitochondrialtargetingpeptide,MTP)、葉綠體運輸肽(chloroplasttransitpeptide,CTP)

和核定位信號(nuclearlocalizationsignals,NLS)。24第二十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五互聯(lián)網(wǎng)上常用的亞細胞定位預測軟件軟件名稱網(wǎng)址(URL)預測功能預測依據(jù)ChloropPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/Chlorop/

葉綠體蛋白質(zhì)識別CTPMitoProthttp://www.mips.biochem.mpg.de/cgi-bin/proj/medgen/mitofilter

線粒體蛋白質(zhì)識別MTPSignalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP

分泌蛋白識別SPpredictNLS/predicNLS/

核蛋白質(zhì)識別NLSPredotarhttp://www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar

線粒體和葉綠體蛋白質(zhì)識別MTP和CTPTMHMMhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHM-2.0

膜蛋白質(zhì)識別跨膜螺旋和拓撲結(jié)構(gòu)HMMTOPhttp://www.enzim.hu/hmmtop/

膜蛋白質(zhì)識別跨膜螺旋和拓撲結(jié)構(gòu)SobLoc/SubLoc

12種亞細胞定位氨基酸組成分析NNPSLhttp://predic.sanger.ac.uk/nnpsl

5種亞細胞定位氨基酸組成分析TargetPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TaregtP/

4類亞細胞定位SignalP、ChloropP和MTP識別三者相結(jié)合PSORThttp://psort.nibb.ac.jp/

12種亞細胞定位氨基酸組成與分揀信號識別相結(jié)合

注：CTP葉綠體運輸肽(chloroplasttransitpeptide);NLS核定位信號(nuclearlocalizationsignals);MTP線粒體引導肽(mitochondrialtargetingpeptide);SP信號肽(signalpeptide)。25第二十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五

亞細胞定位預測的方法的建立包括四個步驟：（四）蛋白質(zhì)亞細胞定位預測技術1.建立客觀、有代表性的各種已知亞細胞定位的訓練用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)系列(trainingdataset)；2.從蛋白數(shù)據(jù)系列中抽提出各種特征信息參數(shù)；3.根據(jù)特征信息參數(shù)采用一些算法建立算法模型以計算比較可疑蛋白質(zhì)某種亞細胞定位的可能性4.采用檢驗用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)系列(testingdataset)結(jié)合不同評價方法對所建立算法模型的預測結(jié)果進行評價。26第二十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五四、亞細胞蛋白質(zhì)組學研究進展1.細胞器的蛋白質(zhì)組學研究2.大分子結(jié)構(gòu)體和多蛋白復合體的蛋白質(zhì)組學研究3.模式生物的亞細胞蛋白質(zhì)組學研究4.將定量技術和差異分析引入亞細胞蛋白質(zhì)組學27第二十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)細胞膜的蛋白質(zhì)組學研究進展一、細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能

真核生物中，細胞質(zhì)膜(plasmamembrane)與細胞內(nèi)膜統(tǒng)稱為生物膜

(biomembrane)。

與細胞起源、細胞分裂分化、細胞識別、免疫、物質(zhì)運輸、信息傳遞、代謝調(diào)控、能量轉(zhuǎn)換、神經(jīng)傳導以及腫瘤的發(fā)生均有關。28第二十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)（包括酶）脂類糖類（糖脂和糖蛋白）50%40%10%29第二十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五二、膜蛋白質(zhì)的特點

根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大基本類型：外在膜蛋白

(extrinsicmembraneproteins)或外周膜蛋白

(peripheralmembraneproetins)內(nèi)在膜蛋白

(intrinsicmembraneproteins)或整合膜蛋白

(integralmembraneproetins)水溶性，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合改變?nèi)芤旱碾x子強度甚至提高溫度就可以分離，結(jié)構(gòu)不被破壞。雙型性，以不同程度嵌入脂雙層內(nèi)不，疏水區(qū)域與脂雙層中脂類分子的疏水尾部作用，親水區(qū)域暴露在膜的一側(cè)或兩側(cè)表面。不易分離，優(yōu)質(zhì)用去垢劑才可分離，但分離后易失去正常構(gòu)型。>30第三十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五三、膜蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳技術研究

細胞質(zhì)膜負責細胞內(nèi)外環(huán)境物質(zhì)和信息的交流，在受體介導的信號跨膜傳導、物質(zhì)的轉(zhuǎn)運等方面發(fā)揮重要作用。

細胞質(zhì)膜是廣泛的藥物設計靶標，細胞質(zhì)膜蛋白占整個已知藥物靶標的70％。所以，用蛋白質(zhì)組學方法分析細胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)倍受關注。31第三十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五三、膜蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳技術研究

膜蛋白的不易分離和疏水特性對傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學技術尤其是雙向凝膠電泳技術提出了嚴峻挑戰(zhàn)。

各種新的破膜劑、表面活性劑、還原劑的使用

如：硫脲與尿素的聯(lián)用；

β-硫代型兩性離子表面活性劑如CHAPS；

TBP(tributylphosphine)代替常規(guī)還原劑二巰基乙醇DTT。

新的抽提方案出現(xiàn)如：膜蛋白組分的分級抽提、采用雙向變性劑TritonX-144或進行Na2CO3預處理膜蛋白組分，分離內(nèi)在膜蛋白以及采用有機溶劑抽提膜蛋白等。32第三十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五四、膜蛋白質(zhì)的非雙向電泳技術研究

單向SDS直接與質(zhì)譜技術結(jié)合分離鑒定膜蛋白混合物，已成為一種趨勢，可避免采用固化pH梯度進行等電聚焦過程造成的膜蛋白質(zhì)的丟失。

用于直接分析大蛋白復合體(directanalysisoflargeproteincomplexes,DALPC)的多維色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的2D-LC-MS/MS技術，避免了雙向電泳技術分離中等電點極限、疏水性、相對分子質(zhì)量范圍等因素的限制。33第三十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)高爾基體蛋白質(zhì)組學研究進展一、高爾基體的結(jié)構(gòu)與功能

高爾基體(Golgibody)

又稱高爾基器(Golgiappa-ratus)或高爾基復合體(Golgicomplex)，是真核細胞內(nèi)的一種重要細胞器。

高爾基體是由大小不一、形態(tài)多變的囊泡體系組成，在不同的細胞中，甚至細胞生長的不同階段都有很大的區(qū)別。有時不易辨認，而且更難分離與純化，再加上一般動物細胞中數(shù)目較少，在含量豐富的肝細胞中也僅有50個左右的高爾基體。因此對高爾基體的結(jié)構(gòu)與功能的研究，一直是細胞生物學家面臨的挑戰(zhàn)性難題之一。34第三十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、高爾基體的結(jié)構(gòu)與功能

電子顯微鏡所觀察到的高爾基體最富有特征的結(jié)構(gòu)是由一些（常常4～8個）排列較為整齊的扁平膜囊（saccules）堆疊在一起，構(gòu)成了高爾基體的主體結(jié)構(gòu)，扁囊多呈弓形，也有的呈半球形或球形。膜囊周圍又有大量的大小不等的囊泡結(jié)構(gòu)。

高爾基體是一種有極性的細胞器，靠近細胞核的一面，扁囊彎曲成凸面又稱形成面(formingface)或順面(cisface)，面向細胞質(zhì)膜的一面常呈凹面(concave)又稱成熟面(matureface)或反面(transface)。

35第三十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、高爾基體的結(jié)構(gòu)與功能

高爾基體是細胞內(nèi)大分子運輸?shù)囊粋€主要交通樞紐，主要參與了細胞的分泌活動，是糖類合成和蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要場所。蛋白質(zhì)的加工、分類、包裝與運送脂類向質(zhì)膜和溶酶體膜等部位的運輸糖類生物合成的主要場所36第三十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五二、高爾基體的蛋白質(zhì)組學研究

據(jù)估計，高爾基體至少有1000種組成性蛋白質(zhì)，而從哺乳動物各種組織中只鑒定出200余種高爾基體蛋白質(zhì)。1997-2000年，Taylor等先后采用放線菌酮預處理的辦法，結(jié)合差速離心、蔗糖密度梯度離心和去垢劑抽提，通過雙向電泳和串聯(lián)質(zhì)譜的技術在高爾基體組分中分離鑒定93個蛋白質(zhì)，建立了第一個哺乳動物高爾基體蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫。1982年，Howell研究小組發(fā)現(xiàn)在生理狀態(tài)下，大鼠肝組織高爾基體中約50%的蛋白質(zhì)都屬于一過性運輸?shù)鞍踪|(zhì)。37第三十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五三、蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)新的高爾基體蛋白質(zhì)2004年，Wu等采用MudPIT方法對高爾基體進一步分析，421種蛋白質(zhì)在高爾基體組分中得到鑒定，其中41種蛋白質(zhì)屬于新蛋白質(zhì)。通過對數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)在這421種蛋白質(zhì)中有15種有精氨酸甲基化修飾，這提示高爾基體可能執(zhí)行一種新的翻譯后修飾方式。2001年，Bell等結(jié)合差速離心和蔗糖密度梯度離心獲得高度富集的高爾基體組分并利用TritonX-114抽提蛋白組分，采用單向SDS分離，通過基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜技術檢測肽質(zhì)量指紋圖譜、串聯(lián)質(zhì)譜技術產(chǎn)生肽序列標簽和Edman降解法測定氨基酸序列等方法相結(jié)合，共鑒定出81種蛋白質(zhì)，其中鑒定出34000Da新蛋白質(zhì)GPP34并將其分布定位于高爾基體內(nèi)。38第三十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五四、不同功能狀態(tài)高爾基體的比較蛋白質(zhì)組學研究2000年，Wu等對乳腺上皮細胞這兩種功能狀態(tài)的高爾基體進行了比較蛋白質(zhì)組學研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定出30種上調(diào)蛋白：乳腺上皮細胞在分娩前后由懷孕末期基礎分泌狀態(tài)到哺乳期最大分泌狀態(tài)時，Golgibody所占細胞容積由1%-3%增大到5%-15%，高爾基體中小池總數(shù)增加2倍以上。6種膜內(nèi)蛋白質(zhì)（包括膜聯(lián)蛋白和突觸結(jié)合蛋白）6種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)4種微管運動蛋白4種肌動蛋白調(diào)控蛋白其中：

這4類蛋白質(zhì)的上調(diào)于觀察到的高爾基體在最大分泌狀態(tài)時分泌小泡增多及融合、外排活動增加相一致。39第三十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)核孔復合體蛋白質(zhì)組學研究進展

核孔是細胞核與細胞質(zhì)之間物質(zhì)交換的通道，一方面核的蛋白都是在細胞質(zhì)中合成的，通過核孔定向輸入細胞核，另一方面細胞核中合成的各類RNA、核糖體亞單位需要通過核孔運到細胞質(zhì)。40第四十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、核孔復合體的結(jié)構(gòu)和功能

核孔復合體(nuclearporecomplex,NPC)是一個直徑為120nm的胞質(zhì)環(huán)(cyto-plasmicring)

和核質(zhì)環(huán)(nucl-eoplasmicring)所組成的滴漏(hourglass)樣的結(jié)構(gòu)。

該模型特點幾乎為各種真核生物所共有，而且許多核孔蛋白(nucleoporins,nups)在不同物種間高度保守。41第四十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、核孔復合體的結(jié)構(gòu)和功能

核孔復合體是一種特殊的跨膜運輸?shù)鞍踪|(zhì)復合體，構(gòu)成了核質(zhì)間雙向運輸?shù)挠H水性通道。抽提后的核孔復合體胞質(zhì)面結(jié)構(gòu)圖抽提后的核孔復合體核質(zhì)面結(jié)構(gòu)圖42第四十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、核孔復合體的結(jié)構(gòu)和功能被動擴散主動運輸功能直徑為9-10nm，有的可達12.5nm。允許離子、水溶性分子穿梭于核質(zhì)之間，進行自由擴散。包括親核蛋白質(zhì)的核輸入以及RNA及核糖體亞單位的核輸出等。擴散速度與分子量成反比。小于5×103的可自由進入，大于60×103的球蛋白不能進入。(1)對顆粒大小的限制，一般可達10-20nm，表明核孔復合體的有效直徑是可以調(diào)節(jié)的；(2)主動運輸是信號識別和載體介導的過程，需要ATP；(3)具有雙向性。43第四十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五金顆粒標記的核蛋白穿越核孔通過核孔復合體進行物質(zhì)運輸?shù)墓δ苁疽鈭D44第四十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、核孔復合體的結(jié)構(gòu)和功能

作為核質(zhì)間運輸?shù)奈ㄒ晃稽c，核孔復合體在細胞周期循環(huán)、基因表達調(diào)控以及癌癥發(fā)生等方面都發(fā)揮著重要的作用。

核孔復合體構(gòu)成推測包括100余種不同的多肽，1000多個蛋白質(zhì)分子，統(tǒng)稱為核孔蛋白(nucleoporin,Nup)。已在酵母中鑒定到30余種，在脊椎動物中鑒定到10余種。45第四十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五二、酵母核孔復合體蛋白質(zhì)組學研究2000年Rout等將富集到的酵母核孔復合體組分蛋白質(zhì)經(jīng)羥基磷灰石柱和C4反相柱高效液相色譜分別分離收集得到了80和180個組分。組分經(jīng)膠內(nèi)胰酶酶解、DE-MALDI-TOFMS或MALDiontrapMS分析、搜索NR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫鑒定出174種基因產(chǎn)物。最終確定有40種基因產(chǎn)物與NPC相關，29種為核孔蛋白(nups)，其中7種為新確定的nups，11種為轉(zhuǎn)運因子。Rout等根據(jù)所鑒定的NPC相關蛋白質(zhì)的種類和定位信息，提出了酵母NPC的一種結(jié)構(gòu)模型，并對NPC的物質(zhì)交換機制進行了探討，認為將NPC的核質(zhì)交換可能由結(jié)合、交換、捕獲和釋放等過程完成。46第四十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五三、哺乳動物核孔復合體蛋白質(zhì)組學研究2002年Cronshaw等將大鼠肝細胞核經(jīng)DNase和RNase消化以及肝磷脂抽提除去染色質(zhì)，經(jīng)TritonX-100和SDS處理除去核膜及與核膜相關組分，最后采用兩性離子變性劑選擇性地溶解抽提出包埋于核纖層中的NPC的nups，并進一步經(jīng)C4反相柱分離，通過搜索數(shù)據(jù)庫，共鑒定了94個基因產(chǎn)物，分為23個nups、18個NPC相關蛋白質(zhì)、42個非NPC蛋白質(zhì)和11個功能未名蛋白質(zhì)。免疫熒光共定位實驗證明其中6個功能未明蛋白質(zhì)定位于NPC。還發(fā)現(xiàn)了一類新型的具有WD重復序列的核孔蛋白。47第四十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五結(jié)構(gòu)學比較表明，脊椎動物核孔復合體較酵母的大，其分子質(zhì)量也遠大于酵母。但對二者的蛋白質(zhì)組學研究表明，它們都只由約30種nups組成，這主要是與多拷貝高分子質(zhì)量的核孔蛋白形成核孔復合體的對稱性結(jié)構(gòu)有關。而且約2/3的nups在二者間保守，表明哺乳動物與酵母的核孔復合體雖然存在大小和組成上的差異，但在結(jié)構(gòu)和功能上仍有進化的保守性。上述二者的研究分別發(fā)現(xiàn)了7種和6種新的核孔蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了一類新型的具有WD重復序列的核孔蛋白質(zhì)，并對核孔復合體的分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)模型和核質(zhì)交換功能的機制進行了深入的探討。小結(jié)48第四十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五第五節(jié)核仁蛋白質(zhì)組學研究進展

核仁(nucleolus)

是真核細胞核內(nèi)一動態(tài)組織結(jié)構(gòu)，除具有核糖體亞基的生物生成功能外，已發(fā)現(xiàn)還具有其他多種生物功能。核仁的蛋白質(zhì)組學研究將促進深入理解核仁的細胞周期性的動態(tài)變化以及具有的多種生物功能機制。49第四十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、核仁的結(jié)構(gòu)和功能

核仁是一動態(tài)結(jié)構(gòu)，在真核細胞分裂間期核中結(jié)構(gòu)最明顯，在每個細胞周期中經(jīng)歷解聚與重建的過程。

電鏡下核仁的超微結(jié)構(gòu)包括3個特征性區(qū)域：纖維中心(fibrillarcenter,FC)

致密纖維組分(densefibrillarcomponent,DFC)

顆粒組分(granularcomponent,GC)rDNA轉(zhuǎn)錄局限在FC周邊部分，促使rRNA轉(zhuǎn)錄物聚集于DFC進行修飾處理，而在GC中組裝成核糖體亞單位。50第五十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、核仁的結(jié)構(gòu)和功能

核仁最主要的功能是核糖體亞基的生物生成，包括rRNA的合成、加工和核糖體亞單位的組裝等過程。

其他功能還包括：如信號識別顆粒(signalrecognitionparticle,SRP)、剪接體中的小核蛋白體和端粒酶等的生成和成熟，以及一些mRNAs和tRNAs的轉(zhuǎn)錄后處理以及核輸出，并通過扣押機制調(diào)控一些特殊調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的的活性等。51第五十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、核仁的結(jié)構(gòu)和功能

核仁的主要成分為蛋白質(zhì)，為核仁干重的80%；RNA為核仁干重10%左右；DNA含量較RNA少；脂類的含量極少。

細胞化學研究法發(fā)現(xiàn)核仁中存在堿性磷酸酶、ATP酶等多種酶系。對核仁中蛋白質(zhì)組成的了解將促進對核仁結(jié)構(gòu)及多種功能的認識。52第五十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五二、核仁的蛋白質(zhì)組學研究進展2002年Andersen等聯(lián)合應用超聲波和蔗糖密度梯度離心技術分離純化出Hela細胞的核仁，組分蛋白質(zhì)分別經(jīng)Tris-甘氨酸、Tris-乙酸鹽1DSDS和2DSDS獲得最大分離，凝膠切點酶解后應用質(zhì)譜分析，共鑒定271個基因產(chǎn)物，其中30.5%為新基因產(chǎn)物、22%為核苷酸或核酸結(jié)合蛋白質(zhì)、14%為核糖體蛋白質(zhì)、9%為RNA修飾酶或相關蛋白質(zhì)、5%為含具有RNA依賴的ATP酶和螺旋酶活性的蛋白質(zhì)、5%為分子伴侶蛋白質(zhì)，另外還有3.5%的翻譯因子。同時，Andersen等采用轉(zhuǎn)錄抑制性藥物ActinomycinD處理Hela細胞，對比處理組和對照組鑒定出11種蛋白質(zhì)的豐度在處理組的核仁中有增加。通過熒光定位觀察，發(fā)現(xiàn)其中部分蛋白在對照組細胞中主要存在于核基質(zhì)，但經(jīng)ActinomycinD處理后，移位到了核仁中。53第五十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五第六節(jié)線粒體蛋白質(zhì)組學研究

線粒體(Mitochondrion)

是細胞的動力工廠，哺乳動物呼吸所需要的80％-90％的ATP是由它供給的，而且線粒體也參與細胞凋亡，離子平衡的調(diào)節(jié)，碳水化合物和脂肪酸的代謝等多種細胞生理病理活動。

Science于1999年3月發(fā)表了“Mitochondrialmakeacomeback”專題系列論文，重申線粒體再度成為當前生命科學和分子醫(yī)學中的熱點和前沿。54第五十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能

線粒體的外形多種多樣，如橢圓形、啞鈴形、環(huán)形、圓柱形等，與細胞類型和所處的生理條件有關，最常見是呈線狀或顆粒狀。

線粒體的數(shù)目在不同類型細胞中差異很大，哺乳動物成熟的紅細胞中沒有線粒體，一般動物細胞中平均有數(shù)百個。

植物細胞中線粒體含量比動物細胞要少，可能與富含葉綠體有關。

線粒體的數(shù)目與細胞的生理功能及需求密切相關，需要能將較多的細胞，線粒體的數(shù)目也較多。55第五十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能

電鏡下觀察，線粒體有著同樣的結(jié)構(gòu)，是一個由內(nèi)外兩層單位膜構(gòu)成的封閉的囊狀結(jié)構(gòu)，主要由外膜

(outermembrane)、內(nèi)膜

(innermembrane)、膜間隙(intermem-branespace)及基質(zhì)

(matrix)或內(nèi)室

(innerchamber)組成。

外膜上有排列整齊的筒狀圓柱體，其成分為孔蛋白(porin),相對分子量為1.0×104以下的小分子物質(zhì)均可通過小孔進入膜間隙。內(nèi)膜對物質(zhì)的通透性很低，能嚴格地控制分子和離子通過，這種“不透性”(imperme-ability)在ATP的生成過程中起重要作用。內(nèi)膜向線粒體內(nèi)室褶疊形成嵴(cristae),其形狀和數(shù)量與細胞種類及生理狀況密切相關?；|(zhì)為內(nèi)膜所包圍的嵴外空間，腔內(nèi)充滿可溶性蛋白質(zhì)性質(zhì)的膠狀物質(zhì)，呈均質(zhì)狀，具有一定的pH值和滲透壓。56第五十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能

蛋白質(zhì)占線粒體干重的65～70％，脂類占25～30％蛋白質(zhì)在線粒體各組成部分中分布有很大差異。大鼠肝細胞線粒體蛋白質(zhì)的67％在基質(zhì)內(nèi)，21％在內(nèi)膜，6％在外膜，6％在膜間隙。

線粒體的化學組成主要是蛋白質(zhì)，其次是脂類，另外還有許多輔酶、維生素、金屬離子和線粒體DNA、RNA和核糖體等。57第五十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五

線粒體中已被確認的酶有上百種，分布在各個結(jié)構(gòu)組分中。如外膜中含有合成線粒體脂類的酶類，內(nèi)膜中含有執(zhí)行呼吸鏈氧化反應的酶系和ATP合成酶系；基質(zhì)中有高濃度的多種酶的混合物，如參與三羧酸循環(huán)反應、丙酮酸與脂肪酸氧化的酶系和蛋白質(zhì)與核酸合成酶類等。

線粒體的蛋白質(zhì)可分為可溶性與不溶性兩類?？扇苄缘鞍状蠖鄶?shù)是基質(zhì)中的酶和膜的外周蛋白；不溶性蛋白是膜的鑲嵌蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和部分酶蛋白。

一、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能58第五十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能

線粒體不僅維持細胞正常生理功能，在細胞凋亡和死亡中也發(fā)揮了重要作用。

線粒體是細胞能量生成場所，通過氧化磷酸化為機體提供90%的ATP能源；

與細胞中氧自由基的生成、細胞程序性死亡、細胞的信號轉(zhuǎn)導、細胞內(nèi)多種離子的跨膜轉(zhuǎn)運及電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控包括線粒體對細胞中Ca2+的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等有關。59第五十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五一、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能

線粒體與疾病

線粒體在生物體的生長、發(fā)育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進化等方面都有非常重要的意義。

線粒體與疾病、衰老和細胞凋亡有關，線粒體的異常會影響整個細胞的正常功能，從而導致病變。有人將這一類疾病稱為“線粒體病”(MitochondrialDiseases，MD)?！熬€粒體病”的研究已與線粒體DNA(mtDNA)的損傷、缺失相聯(lián)系。主要表現(xiàn)為呼吸鏈的電子傳遞酶系和氧化磷酸化酶系的異常。60第六十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五二、線粒體的分離純化基本步驟：制備組織或細胞勻漿進行差速離心如有必要，還可進行密度梯度離心而進一步純化

組織細胞的特異性及所研究線粒體的實驗用途據(jù)定了方法的細節(jié)，比如：勻漿器的選擇、緩沖液的成分、許可混雜其他細胞器的程度等。61第六十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五三、線粒體的蛋白質(zhì)組學研究

最近線粒體蛋白質(zhì)組學研究比較多，已經(jīng)成為亞細胞蛋白質(zhì)組學研究的典范。估計線粒體含有至少1500種不同的蛋白質(zhì)。2001年Kruft等對擬南芥線粒體進行了蛋白質(zhì)組學研究，通過IEF/TricineSDS雙向電泳得到650個蛋白質(zhì)點，鑒定出其中的52個，進行了功能分類。同時，Millar等也發(fā)表了對擬南芥線粒體蛋白質(zhì)組學研究論文，雙向電泳顯示了約100種高豐度蛋白質(zhì)和250種低豐度蛋白質(zhì)，并將樣品按照膜關聯(lián)程度進一步分機，得到全部蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)、膜蛋白質(zhì)和內(nèi)在膜蛋白質(zhì)的2D圖譜。62第六十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五三、線粒體的蛋白質(zhì)組學研究

最大規(guī)模的運用2D分析線粒體蛋白質(zhì)組的研究是針對大鼠肝臟線粒體進行的。2000年Lopez等使用高通量自動化設備結(jié)合親和層析技術鑒定了數(shù)百種線粒體蛋白，并用親和技術分別富集了鈣結(jié)合蛋白質(zhì)、糖蛋白和膜蛋白，獲得了2D圖譜。2002年Fountoulakis等采用pH3~10非線性、pH4~7線性、pH5.5~6.7線性3種IPG膠條進行第一相IEF電泳分離，SDS進行第二相分離，質(zhì)譜檢測到192種基因產(chǎn)物，其中42%的蛋白質(zhì)點已被亞細胞定位于線粒體中，其中8種基因產(chǎn)物為首次檢測且均由一個蛋白質(zhì)點代表。63第六十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五2003年Sickmann等利用多種蛋白質(zhì)分離鑒定路線，鑒定到了750種酵母蛋白質(zhì)，建立了目前最大的線粒體蛋白質(zhì)表達譜。三、線粒體的蛋白質(zhì)組學研究2003年Taylor等采用SDS結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜方法對人心肌線粒體進行分析，鑒定出615種蛋白質(zhì)；隨后，Gaucher等采用MudTIP技術拓展了人心肌線粒體蛋白質(zhì)組的研究。上述蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)為進一步分析線粒體的功能提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。線粒體內(nèi)膜在線粒體功能發(fā)揮中起重要作用，于是就有研究者專門研究線粒體內(nèi)膜蛋白的組成。他們利用二維色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析內(nèi)膜蛋白質(zhì)組，總共鑒定了183個蛋白質(zhì)，其中22個是未知的或以前沒有發(fā)現(xiàn)與線粒體內(nèi)膜有關。64第六十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五四、線粒體的三維分離及線粒體亞組分的蛋白質(zhì)組學研究

線粒體的2D圖譜大多是溶解整個線粒體乃至整個細胞所得，這使得2D圖譜含有的點過多，反而不利于分析。這類圖譜也難以提供單個多蛋白質(zhì)復合體的蛋白質(zhì)組成信息和功能信息。

背景65第六十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五四、線粒體的三維分離及線粒體亞組分的蛋白質(zhì)組學研究

三維分離技術2001年Hanson等將蔗糖密度梯度離心與雙向凝膠電泳技術結(jié)合，形成線粒體蛋白質(zhì)的三維分離，其中蔗糖密度梯度離心可按大小分離線粒體中的蛋白質(zhì)復合物。該法在線粒體的應用有助于解決等電點聚焦過程中蛋白質(zhì)的分辨問題以及疏水蛋白質(zhì)的溶解問題等，并可以提供線粒體多蛋白質(zhì)復合體的結(jié)構(gòu)功能信息。66第六十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五2002年Werhahn等也發(fā)展了一種3D電泳，首先用Blue-nativePAGE

分離線粒體多蛋白質(zhì)復合體，再電洗脫至完全解離考馬斯亮藍染料，沉淀后再以IEF/SDS分離多蛋白質(zhì)復合體，形成Blue-native/IEF/SDS三維電泳。

三維分離技術對線粒體組分再次細分，進一步富集了低豐度蛋白質(zhì)，提高了蛋白質(zhì)組圖譜的分辨率；并使分離鑒定線粒體中多蛋白質(zhì)復合體的蛋白質(zhì)組成成為可能，促進了對所有線粒體蛋白質(zhì)組成及其功能的研究。四、線粒體的三維分離及線粒體亞組分的蛋白質(zhì)組學研究67第六十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五

亞組分蛋白質(zhì)組學研究1998年Jansch等以Blue-nativePAGE/TricineSDS分別分離了馬鈴薯和擬南芥線粒體外膜移位酶(TOM)復合物，分別得到了7種和6