微生物的分離純化

微生物的分離與純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求?）學(xué)習(xí)微生物的分離技術(shù)。（2）學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。（3）學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)法。以細(xì)菌為例實(shí)驗(yàn)原理純種分離技術(shù)分離：從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純種的方法。純種（純培養(yǎng)）：一個(gè)菌落或一個(gè)培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞是由一個(gè)細(xì)菌（或細(xì)胞）分裂繁殖而產(chǎn)生的后代。

微生物的分離與純化技術(shù)的應(yīng)用：分離具有特殊功能的微生物、優(yōu)良菌種及純化被污染的菌種等。

土壤是微生物的大本營，混雜著大量的微生物，從中分離可得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)。分離純化：菌種被其他雜菌污染或混合菌懸液常要進(jìn)行分離純化；方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法兩種。

要獲得某種微生物的純種，還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在30-37℃溫度下培養(yǎng)1-2天。

平板菌落計(jì)數(shù)——活菌計(jì)數(shù)0.90.10.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.9ml分離純化基本流程實(shí)驗(yàn)儀器、材料實(shí)驗(yàn)材料菌源:土樣10g;培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)儀器與用具1)超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈2）1000ul及100ul移液槍、1000ul及100ul槍頭、無菌1.5ml的離心管、離心管架3）無菌平皿、涂布器、接種環(huán)實(shí)驗(yàn)試劑:無菌水;實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、土樣取樣:

選擇肥沃土壤,去表層土,挖3－8cm深度的土壤數(shù)10g,裝入已滅菌的牛皮紙袋,封好袋口,帶回實(shí)驗(yàn)室。2、制備土壤稀釋液：

稱取土樣1.0g，放入盛99ml無菌水的三角瓶中，置搖床振蕩20min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-2）。用100ul移液槍從中吸取100ul土壤懸液，注入事先分裝有900ul無菌水的離心管中，吹吸3次，振蕩均勻（10-3）。然后同樣方法，配置成稀釋度為10-4，10-5的土壤菌懸液。3、分離

稀釋涂布平板法用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無菌涂布器涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板（重復(fù)）。注意：無菌操作；用槍頭吸取菌懸液時(shí)注意“吹打數(shù)次”確?；靹颉?、培養(yǎng)待平板上液體被完全吸收，將平板倒置于370C溫箱中培養(yǎng)24h；5、菌落計(jì)數(shù)

含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個(gè)活菌細(xì)胞可在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見的菌落，故可據(jù)平板上菌落的數(shù)目推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數(shù)（菌落形成數(shù)目）。

選擇平均菌落數(shù)在30~300間的平板，求其平均值。

每克含菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)（菌落形成數(shù)（同一稀釋度平板上菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)）/含菌樣品克數(shù)菌落計(jì)數(shù)規(guī)則：選擇平均菌落數(shù)在30~300間的平板1、只有一個(gè)稀釋度符合，則以該稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；2、有兩個(gè)稀釋度符合，取決于二者比值（高稀釋度的菌落數(shù)除以低稀釋度的菌落數(shù)的值）：1）若0.5≤比值≤2，以兩稀釋度的菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)所得的值的均值。2）若2≤比值或比值≤0.5，則取其中較少的菌落總數(shù)。

3、若所有稀釋度的菌落平均數(shù)均大于300，則按稀釋倍數(shù)最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；4、若所有稀釋度的菌落平均數(shù)均小于30，則按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；所有菌落數(shù)均不在30~300間以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)6、平板劃線法挑取單個(gè)菌落（細(xì)菌菌落），分別在平板上做分區(qū)和劃線。370C培養(yǎng)48h檢查菌落是否單純。無菌操作（近火焰處操作）：劃線方法：：灼燒、冷卻、取菌區(qū)1劃線灼燒、冷卻區(qū)2劃線區(qū)3劃線