雙氫青蒿素對(duì)人喉癌細(xì)胞HeP

雙氫青蒿素對(duì)人喉癌細(xì)胞HeP【摘要】目的：雙氫青蒿素作用于人喉癌細(xì)胞，觀察藥物對(duì)其生長(zhǎng)抑制作用.方法：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)等觀察、測(cè)定雙氫青蒿素對(duì)喉癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖率、細(xì)胞群體倍增時(shí)間、雙氫青蒿素對(duì)HeP2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的劑量－效應(yīng)曲線、時(shí)間－效應(yīng)曲線以及對(duì)該細(xì)胞克隆形成率的影響.結(jié)果：①細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示該細(xì)胞增殖活躍，生長(zhǎng)穩(wěn)定，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為247h；②雙氫青蒿素對(duì)Hep2細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,其作用特點(diǎn)呈濃度依賴(lài)性，其IC50值為446684μg/L.時(shí)間－效應(yīng)曲線顯示：當(dāng)作用時(shí)間在24~120h時(shí)，呈劑量依賴(lài)性關(guān)系及時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系.③雙氫青蒿素藥物濃度分別為320、1000、3200、10000μg/L時(shí)，克隆形成率分別為1150、09、06和05.結(jié)論：雙氫青蒿素對(duì)HeP2細(xì)胞增殖及其生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，表明雙氫青蒿素在喉癌的化學(xué)治療中對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用.

【關(guān)鍵詞】腫瘤；細(xì)胞；青蒿素；喉腫瘤

0引言

腫瘤的形成是一個(gè)多因素、多階段、長(zhǎng)期作用的過(guò)程，惡性腫瘤的形成是細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂且復(fù)雜的過(guò)程.有資料表明，青蒿素及其衍生物對(duì)鼠艾氏腹水瘤細(xì)胞和人Hela細(xì)胞有細(xì)胞毒活性.用青蒿琥酯處理的HepG細(xì)胞可見(jiàn)梯狀DNA和凋亡小體［1］.本實(shí)驗(yàn)將雙氫青蒿素作用于HeP2細(xì)胞，觀察對(duì)其生長(zhǎng)抑制作用，旨在探討抗腫瘤侵襲及腫瘤治療方面為臨床用藥的篩選奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1材料和方法

11細(xì)胞來(lái)源HeP2細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)秦都口腔醫(yī)學(xué)院口腔生物學(xué)教研室提供.細(xì)胞培養(yǎng)于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，體積分?jǐn)?shù)為50mL/LCO2，37℃，飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng).

12主要實(shí)驗(yàn)儀器、試劑雙氫青蒿素純品由北京科泰新技術(shù)公司方輝藥業(yè)有限公司提供,生理鹽水稀釋?zhuān)籑TT為Sigma公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶為Gibco產(chǎn)品.

13細(xì)胞增殖率測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeP2細(xì)胞，常規(guī)消化后接種于24孔培養(yǎng)板，接種濃度為1×107個(gè)/L，計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值作圖并計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間.細(xì)胞群體倍增時(shí)間計(jì)算公式:DT(h)=t×lg2/(LgNt-lgNo)t代表細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)時(shí)間，No及Nt分別代表對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的起始和終止的細(xì)胞數(shù).

14雙氫青蒿素對(duì)HeP2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的劑量－效應(yīng)曲線取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化后以1×106個(gè)/L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，24h后細(xì)胞貼壁.加入濃度為100～32000μg/L的6個(gè)濃度的雙氫青蒿素，對(duì)照組加入不含藥物的等體積RPMI1640培養(yǎng)液，每組分別設(shè)5個(gè)平行孔.常規(guī)培養(yǎng)5d，MTT比色法測(cè)定每組A490nm值.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值作圖.以藥物劑量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制劑量－效應(yīng)曲線、時(shí)間效應(yīng)曲線計(jì)算IC50值.

15雙氫青蒿素對(duì)HeP2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的時(shí)間－效應(yīng)曲線接種細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)加藥分組同14.分別于藥物作用1、2、3、4、5d后，MTT比色法測(cè)定每組A490nm值.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，繪制時(shí)間－效應(yīng)曲線并計(jì)算IC50值.

16軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)采用雙層瓊脂培養(yǎng)法在24孔板中進(jìn)行，底層含5mL/L瓊脂，每孔1mL，4℃凝固.對(duì)照組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液.每組分別設(shè)4個(gè)平行孔.實(shí)驗(yàn)組雙氫青蒿素藥物濃度分別為320、1000、3200、10000、32000μg/L.常規(guī)培養(yǎng)2wk.倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.按公式計(jì)算克隆形成率×100％.

17數(shù)據(jù)處理與分析細(xì)胞生長(zhǎng)存活率=實(shí)驗(yàn)組光吸收值÷對(duì)照組光吸收值×100%.IC50定義為使實(shí)驗(yàn)組光吸收值下降至對(duì)照組的50%時(shí)的藥物濃度，應(yīng)用MicrosoftEXCEL軟件繪制劑量－效應(yīng)曲線，作圖法計(jì)算雙氫青蒿素對(duì)Hep2細(xì)胞的IC50值.

2結(jié)果

21HeP2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示該細(xì)胞增殖活躍，生長(zhǎng)穩(wěn)定，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為247h，表明該細(xì)胞適合在觀察生長(zhǎng)變化的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用.

22雙氫青蒿素對(duì)Hep2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用雙氫青蒿素作用于Hep2細(xì)胞,在小劑量情況下對(duì)細(xì)胞殺傷作用較輕,隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制，其作用特點(diǎn)表現(xiàn)為明顯的濃度依賴(lài)性，IC50值為446684μg/L.雙氫青蒿素對(duì)Hep2細(xì)胞藥物劑量－效應(yīng)曲線見(jiàn)Fig2.雙氫青蒿素作用于Hep2細(xì)胞的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系如Fig3所示,藥物各濃度作用組在作用12h內(nèi)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，當(dāng)作用時(shí)間在24~120h時(shí)，表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性關(guān)系及時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系.

23雙氫青蒿素作用Hep2細(xì)胞克隆形成率檢測(cè)雙氫青蒿素作用于Hep2細(xì)胞可顯著降低其克隆形成率.試驗(yàn)可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成逐漸減少，對(duì)照組及各濃度組克隆形成數(shù)及克隆形成率見(jiàn)Tab1.從克隆形態(tài)觀察，對(duì)照組克隆體積大且呈球狀，實(shí)驗(yàn)組克隆體積小，形態(tài)不規(guī)則.表1雙氫青蒿素作用HeP2細(xì)胞克隆數(shù)及克隆率

3討論

腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展取決于腫瘤細(xì)胞的增殖與死亡比例,防治腫瘤是降低惡性腫瘤死亡率的重要途徑之一,有關(guān)腫瘤治療研究成為國(guó)際上關(guān)注的課題.目前從腫瘤的分子發(fā)生上講，腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活、抑癌基因的抑制調(diào)節(jié)基因和DNA修復(fù)基因的異常等細(xì)胞增殖分化以及死亡平衡失調(diào)等多種因素有關(guān).惡性腫瘤形成的基本模式致瘤因素引起基因損傷，即獲得原癌基因和/或滅活腫瘤抑制基因，可能還累及凋亡基因和/或DNA修復(fù)基因，使細(xì)胞出現(xiàn)多克隆性增殖，在進(jìn)一步基因損傷基礎(chǔ)上，發(fā)展成為克隆性增殖，形成具有不同生物學(xué)特性的亞克隆，獲得浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力.

青蒿素是從菊科艾屬黃花蒿(artemisiaannua)莖葉中提取的一種含過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯.雙氫青蒿素是我國(guó)自行研制的抗瘧新藥，是青蒿素的一個(gè)重要衍生物，由青蒿素經(jīng)四氫硼鈉還原而成［2］.雙氫青蒿素具有吸收良好、分布廣、排泄和代謝迅速、高效、低毒等優(yōu)點(diǎn),其口服生物利用度是青蒿素的10倍以上,抗瘧作用是青蒿素的4～8倍［3，4］.近年來(lái)，青蒿素類(lèi)藥物的應(yīng)用日益廣泛，在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用更為引人注目.對(duì)不同組織中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),雙氫青蒿素對(duì)白血病、黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞株高度敏感,而對(duì)非小細(xì)胞肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌和腎癌細(xì)胞株的活性較低［5］.國(guó)內(nèi)外對(duì)青蒿素類(lèi)藥物抗腫瘤研究相對(duì)集中于白血病、腹水瘤、乳腺癌、肝癌等，在喉癌細(xì)胞方面報(bào)道較少［6］.

喉癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，以磷狀細(xì)胞癌為多見(jiàn)，目前大多數(shù)治療方法為手術(shù)切除后行放療化療.本實(shí)驗(yàn)將雙氫青蒿素作用于喉癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該藥物對(duì)HeP2增殖及其生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，其作用呈明顯的劑量依賴(lài)性；同時(shí)，隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，表明雙氫青蒿素在喉癌的化學(xué)治療中對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用.研究表明，青蒿素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有具有抗癌活性的α次甲基內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的萜類(lèi)化合物，青蒿素的抗腫瘤作用可能與其作用于轉(zhuǎn)鐵蛋白影響細(xì)胞鐵代謝從而抑制其DNA合成達(dá)到抑制細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)［7］，其具體的藥理作用與機(jī)制尚待進(jìn)一步研究.

【參考文獻(xiàn)】

［1］陳沛泉，簡(jiǎn)華香，符林春，等.雙氫青蒿素和奎寧對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)期配子體作用的隨機(jī)比較［Ｊ］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2001;18(1):22.

ChenPQ,JianHX,FuLC,etal.Pairofhydrogenartemisininandcomparingatrandomtomalignantplasmodiumsearlygametophytefunctionofquinine［J］.JGuangzhouUnivTradChinMed,2001;18(1):22.

［2］劉寧,楊臘虎,張正行,等.雙氫青蒿素差向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化的研究［Ｊ］.藥物分析雜志,2002;22(4):303-306.

LiuN,YangLH,ZhangZX,etal.Studiesontheconversionofepimersofdihydroartemisinin［J］.MedAnalMag,2002;22(4):303-306.

［3］李國(guó)棟，周全，趙文長(zhǎng)，等.青蒿素類(lèi)藥物的研究現(xiàn)狀［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志,1998;33(7):385.

LiGD,ZhouQ,ZhaoWC,etal.Researchcurrentsituationofthemedicine［J］.ChinaPharmMag,1998;33(7):385.

［4］宋振玉.雙氫青蒿素在人的藥代動(dòng)力學(xué)及與青蒿素的比較［Ｊ］.藥學(xué)學(xué)報(bào),1993；28(5):342.

SongZY.Pairsofhydrogenartemisininmedicineinpeopletaketheplaceofdynamicsandcomparisonofartemisinin［J］.MedJ,1993;28(5):342.

［5］ChenPQ,YuanJ,DuQY,etal.EffectsofdihydroartemisininonfinestructureofsrythrocyticstagesofplasmodiumbergheiANKAstrain［J］.ActaPharmacolSin,2000;21(3):234.

［6］WangHZ,YangBF,LuoDL,etal.Theresearchofartemisininantiarrythmicac