分子生物學(xué)轉(zhuǎn)錄前的基因活化

分子生物學(xué)轉(zhuǎn)錄前的基因活化第一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因表達調(diào)控的層次

基因表達受發(fā)育階段及環(huán)境因素的影響。生物體對基因表達的調(diào)控有許多的層次，如轉(zhuǎn)錄前的基因活化、轉(zhuǎn)錄過程、轉(zhuǎn)錄后的RNA加工成熟過程、翻譯過程、翻譯后的多肽加工過程。這些過程對于生物生長發(fā)育是非常重要的。第二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五DNA

水平的調(diào)控

某些原生動物、線蟲和甲殼類動物在個體發(fā)育中，體細胞會發(fā)生染色體丟失現(xiàn)象，只有將來分化形成生殖細胞的那些細胞才保持完整的基因組。目前在高等真核生物（包括動、植物）中尚未發(fā)現(xiàn)類似的基因丟失現(xiàn)象。

基因丟失第三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因丟失

馬蛔蟲受精卵里只有一對染色體（2n=2），當(dāng)個體發(fā)育到一定階段后，在將分化為體細胞的那些細胞中，這對染色體破碎成許多小染色體。有的小染色體具有著絲粒，在細胞分裂中得到保留，不具有著絲粒的小染色體因為在以后的細胞分裂中不能分配到下一代細胞中而丟失，在將形成生殖細胞的那些細胞里卻沒有染色體破碎和丟失現(xiàn)象。這些基因的丟失決定了細胞的命運。第四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因丟失（續(xù)）

許多原生動物細胞中（纖毛蟲綱的草履蟲、鐘蟲等）含有兩種類型的核，小核和大核。通常在它們的生殖細胞中只具有一個小核，當(dāng)細胞分化時，小核經(jīng)歷各種變化，最終結(jié)果是產(chǎn)生擁有一個大核和一個小核的雙核細胞。小核中含有無活性的DNA，僅僅為將來產(chǎn)生生殖細胞貯藏遺傳信息；大核中的DNA則是具有轉(zhuǎn)錄活性的模板。第五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因丟失（續(xù)）

在對原生動物Oxytrichia的大核形成過程的研究中發(fā)現(xiàn)，處于生殖細胞中的小核DNA，在分化過程中被切割成長度為500～20000bp的線性片段，而且大部分DNA在形成上述線性片段的過程中被徹底降解。通過一種目前還不清楚的方式，剩下的片段能夠不斷復(fù)制，直到每個細胞中含有17000種不同片段的1000個拷貝為止。這些片段進一步建成大核。在這個過程中，大核所含的DNA是小核DNA的幾百倍，但是丟失了一半以上的小核DNA序列。第六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五DNA水平的調(diào)控

基因擴增

基因擴增是指細胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性地大量增加的現(xiàn)象，它是通過改變基因的數(shù)量而調(diào)節(jié)基因表達的一種調(diào)控方式。當(dāng)發(fā)育分化或環(huán)境條件改變，使對某種基因產(chǎn)物的需要量劇增，單靠調(diào)節(jié)表達活性不足以滿足需要時，依靠基因擴增可迅速增加基因表達產(chǎn)物的量。

第七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因擴增（續(xù)）

在兩棲類和昆蟲的卵母細胞中，為貯備大量核糖體以供胚胎早期發(fā)育的需要，通常專一性地擴增rRNA基因。非洲爪蟾體細胞rDNA拷貝數(shù)約500個，而卵母細胞中rDNA的拷貝數(shù)可達2百萬個，以染色體外環(huán)狀DNA分子的形式存在，每個環(huán)狀DNA分子含2～4個甚至多達16個rRNA基因。這些rDNA約占整個卵母細胞DNA的75%。當(dāng)胚胎期開始時，這些染色體外擴增的環(huán)狀rDNA拷貝即失去功能并逐漸消失。第八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因擴增（續(xù)）

外界環(huán)境因素也可以造成基因擴增。用二氫葉酸還原酶的抑制劑氨甲喋呤處理離體培養(yǎng)的細胞系，可以使這個酶的基因dhfr擴增達到40～400個拷貝，從而產(chǎn)生更高的酶活性來增加對氨甲喋呤的抗性?；驍U增了的細胞系可分為兩大類：一類是穩(wěn)定系（stablelines），無論是否除去氨甲喋呤，擴增的dhfr基因都依然存在；另一類是不穩(wěn)定系（unstablelines），擴增的dhfr基因在除去氨甲喋呤后逐漸消失。第九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因擴增（續(xù)）

穩(wěn)定系中擴增的

dhfr

基因成簇串聯(lián)在一起，位于一條染色體原來的

dhfr

基因位置上，而其同源染色體的

dhfr

基因通常不擴增。不穩(wěn)定系中擴增的

dhfr

基因以雙小染色體（double-minutechromosomes）的形式存在，每個雙小染色體含有2～4個

dhfr

基因，雙小染色體可以自主復(fù)制，但無著絲點，在有絲分裂中不能均等地分配到子細胞中去，并常常因此而丟失。第十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五DNA

水平的調(diào)控基因重排

基因重排是改變基因組中有關(guān)基因序列結(jié)構(gòu)的一種基因表達調(diào)控方式。一個最典型的例子是人和哺乳動物在B淋巴細胞分化期間發(fā)生基因組重建，從而產(chǎn)生抗體的多樣性，以識別和區(qū)分不同結(jié)構(gòu)的抗原。第十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因重排

抗體分子中最主要的IgG是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成。輕鏈和重鏈由3個獨立的多基因家族編碼，其中兩個編碼輕鏈（κ和λ），一個編碼重鏈。第十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因重排

小鼠的κ、λ和重鏈的基因家族分別位于第6、12和16號染色體上。決定輕鏈的基因族上分別由L、V、J、C四類基因片段，L代表前導(dǎo)片段（leadersegment），V代表可變片段（variablesegment），J代表連接片段（joiningsegment），C代表恒定片段（constantsegment）。決定重鏈的基因族上共有L、V、D、J、C五類基因片段，其中D代表多樣性片段（diversitysegment）。第十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五基因重排

小鼠的重鏈和κ鏈基因族各有V片段約200個，λ鏈的V片段有5個；J片段有5個；D片段有12個。人的抗體基因族結(jié)構(gòu)大體相似，但分布在不同染色體上。當(dāng)淋巴細胞受到抗原刺激而分化為漿細胞時，胚原型DNA將發(fā)生基因重排而形成表達型DNA。重鏈取一個V、D、J與L、C重排成表達型DNA，而將其它的V、D、J切除；同樣輕鏈也取一個V、J與L、C重排。這樣每一種淋巴細胞能且僅能產(chǎn)生一種抗體。第十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五鼠胚系Ig基因的構(gòu)成第十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五人胚系Ig基因的構(gòu)成第十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五小鼠Igμ重鏈的基因重排、轉(zhuǎn)錄與合成的順序第十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五小鼠Igμ重鏈的基因重排、轉(zhuǎn)錄與合成的順序（續(xù)）第十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五小鼠Igκ輕鏈的基因重排、轉(zhuǎn)錄與合成的順序第十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五小鼠Igμ重鏈的基因重排、轉(zhuǎn)錄與合成的順序（續(xù)）第二十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五圖11－1真核生物染色體的組裝模式第二十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五常染色質(zhì)和異染色質(zhì)

常染色質(zhì)是間期核內(nèi)凝縮程度相對較低的染色質(zhì)區(qū)，異染色質(zhì)是凝縮程度相對較高的染色質(zhì)區(qū)。按其功能來分，根據(jù)其是否轉(zhuǎn)錄區(qū)域，還可以將染色質(zhì)分為活性染色質(zhì)和非活性染色質(zhì)，異染色質(zhì)中都是非活性染色質(zhì)。常染色質(zhì)中一部分是活性染色質(zhì)，一部分是非活性染色質(zhì)?；钚匀旧|(zhì)伸展成念珠狀，有些地方還與組蛋白分離。

第二十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

DNaseⅠ超敏感位點

用極低濃度的DNaseⅠ對染色質(zhì)進行切割，能夠被切割的位點稱為DNaseⅠ超敏感位點。DNaseⅠ超敏感位點位于活性染色質(zhì)區(qū)。在活性染色質(zhì)區(qū)，由于DNA裸露，易受DNaseⅠ切割。有些DNaseⅠ超敏感位點是一個短的區(qū)域，即30nm纖維為序列特異調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合所中斷的區(qū)域；有些DNaseⅠ超敏感位點是一些較長的區(qū)域，即轉(zhuǎn)錄正在進行的區(qū)域。異染色質(zhì)對DNaseⅠ不敏感。第二十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五常染色質(zhì)，示活性染色質(zhì)和非活性染色質(zhì)及DNaseⅠ超敏感位點非活性染色質(zhì)活性染色質(zhì)極低濃度DNaseⅠ能夠切割的位點稱為DNaseⅠ超敏感位點。成串的非甲基化的CpG序列稱為CpG島第二十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五H1組蛋白的修飾

H1組蛋白結(jié)合在核小體DNA進出口處，并在形成二級結(jié)構(gòu)30nm螺線管時起重要作用。當(dāng)在H1組蛋白特異的氨基酸殘基上發(fā)生磷酸化時，染色質(zhì)凝縮，使該區(qū)域成為異染色質(zhì)。關(guān)閉該區(qū)段的基因表達。第二十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五核心組蛋白修飾

核心組蛋白修飾后會影響它們與DNA的結(jié)合，修飾作用包括乙?；?、磷酸化和甲基化。其中核心組蛋白賴氨酸殘基被乙酰化后，減少了組蛋白的正電荷，降低了與DNA的結(jié)合力。活性染色質(zhì)往往是高度乙?；摹５诙?，共四十三頁，編輯于2023年，星期五非組蛋白修飾

非組蛋白中包括各種轉(zhuǎn)錄因子（反式作用因子），它們的活性也會受到修飾調(diào)節(jié)。在非組蛋白中有一類，由于其在電泳中的高遷移率，故稱為高遷移率蛋白（highmobilitygroup,HMG），它們常與活性染色質(zhì)結(jié)合，并與轉(zhuǎn)錄效率升高相聯(lián)系。第二十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

核基質(zhì)

染色質(zhì)可用鹽、中性去垢劑和Dnase等化學(xué)方法和電泳等物理方法來提取。提取后殘留的結(jié)構(gòu)，即為核基質(zhì)（nuclearmatrix），也稱核骨架（nuclearscaffold）。核基質(zhì)的主要成分是蛋白質(zhì)。間期染色質(zhì)提取后殘留的核基質(zhì)是一種有著不同密度的纖維狀網(wǎng)。第二十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

基質(zhì)附著區(qū)

真核生物的染色體是由周期性緊密結(jié)合在核基質(zhì)上的DNA環(huán)組成的。DNA上與核基質(zhì)結(jié)合的那段序列稱為基質(zhì)附著區(qū)（matrixattachmentregions，MARs），或稱為基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrixassociationregions，MARs）。MARs之間的環(huán)約為5~200kb左右。如果以間期染色質(zhì)平均85kb有一個環(huán)來計算，具有109核苷酸對的二倍體細胞應(yīng)有23,000個MARs。第二十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

基質(zhì)附著區(qū)（續(xù)）

現(xiàn)有的研究表明，MARs序列缺少保守性，它們通常含有約70%的A+T，除此之外缺少共有序列。不同來源的MARs之間不能相互雜交，但可以與不同來源的核基質(zhì)結(jié)合，說明其序列同源性雖差，但在功能進化上卻是保守的。第三十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五圖11－3MAR與核基質(zhì)的相互作用第三十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五圖11－4活體或離體兩種方法檢測MAR（1）與核基質(zhì)結(jié)合活體方法離體方法第三十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五圖11－4活體或離體兩種方法檢測MAR（2）

提取的DNA跑兩個泳道，用特異的DNA探針檢測其中一個泳道，看是否有特異的MAR片段活體方法離體方法第三十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

MARs在基因表達中的作用

MARs在基因表達中可能有4種作用：①邊界元件作用，它確定了獨立的基因調(diào)節(jié)區(qū)域。②染色質(zhì)調(diào)節(jié)作用，MARs作為刺激或阻遏基因表達的順式作用元件，可促進調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合和作用。③作為DNA復(fù)制起點的組成起作用。④對于有絲分裂中期染色體的組裝并保持一定形狀是重要的。第三十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

圖11－7側(cè)向構(gòu)建有MAR的轉(zhuǎn)基因形成獨立活性結(jié)構(gòu)區(qū)MARs的邊界作用第三十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

圖11－6基質(zhì)附著區(qū)（MARs）功能分析1kbDNAβ－云扁豆蛋白基因增強子不能促進表達增強子激活了表達MARs的邊界作用第三十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

MARs的調(diào)節(jié)作用

當(dāng)用一個異源的酵母ARS1MAR作為側(cè)翼的GUS（β—葡糖苷酸酶）報告基因轉(zhuǎn)入煙草細胞，使報告基因的表達水平提高了12倍，最高達24倍。而改用來自煙草內(nèi)源的與核基質(zhì)結(jié)合較強的R67MAR替換上述與核基質(zhì)結(jié)合較弱的酵母ARS1MAR時，GUS的表達水平提高了60倍，最高達140倍。這說明與核基質(zhì)結(jié)合力較強的MAR比結(jié)合力較弱的MAR對基因表達的影響較大。

第三十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

MARs

的調(diào)節(jié)作用（續(xù)）

在對番茄熱激蛋白基因表達的研究中發(fā)現(xiàn)，只有在3’MAR、5’MAR及內(nèi)含子均存在的情況下基因正常表達，缺少其中一個將大大降低基因表達。這說明基因側(cè)翼的MARs和內(nèi)含子對于基因表達的調(diào)控有關(guān)。第三十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五

DNA甲基化

在真核生物DNA中，甲基化發(fā)生在胞苷酸殘基胞嘧啶環(huán)的5位碳原子上。甲基化位點通常在CG序列上。對于植物來說，甲基化還能在CNG序列的C上發(fā)生。

——CG————CNG——