醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)表觀遺傳學(xué)

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)表觀遺傳學(xué)第一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五表觀遺傳學(xué)(epigenetic)：DNA的序列不發(fā)生變化、基因表達(dá)改變、并且這種改變可穩(wěn)定遺傳。表觀遺傳學(xué)研究的內(nèi)容：

基因選擇性轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的調(diào)控?；蜣D(zhuǎn)錄后調(diào)控。第二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五表觀遺傳修飾從多個(gè)水平上調(diào)控基因表達(dá)：

DNA水平：DNA甲基化蛋白質(zhì)水平：組蛋白修飾染色質(zhì)水平：染色質(zhì)重塑RNA水平：miRNA、RNA干擾第三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五表觀遺傳學(xué)的研究意義：表觀遺傳學(xué)補(bǔ)充了“中心法則”所忽略的兩個(gè)問題，即哪些因素決定了基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯以及核酸并不是存儲(chǔ)遺傳信息的唯一載體。表觀遺傳信息可以通過控制基因的表達(dá)時(shí)間、空間和方式來調(diào)控各種生理反應(yīng)。所以許多用DNA序列不能解釋的現(xiàn)象都能夠找到答案。與DNA序列的改變不同，許多表觀遺傳的改變是可逆的，這使表觀遺傳疾病的治愈成為可能。第四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五

第二節(jié)表觀遺傳修飾1、DNA甲基化(DNAmethylation)DNA甲基化是目前研究得最清楚、也是最重要的表觀遺傳修飾形式。通過甲基供體——S-腺苷甲硫氨酸，并在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5’位置的氫被活性甲基所取代，從而轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。第五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五胞嘧啶甲基化反應(yīng)第六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五

DNA復(fù)制酶CH3CH3CH3CH3DNA甲基轉(zhuǎn)移酶CH3CH3CH3CH3DNA復(fù)制后甲基化型的維持第七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五CpG島（CpGisland）第八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五甲基化抑制基因的表達(dá)第九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五DNA甲基化→基因沉默(genesilence)非甲基化(non-methylation)→基因活化(geneactivation)去甲基化(demethylation)→沉默基因的重新激活（reactivation）第十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五DNA高甲基化：基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島在正常狀態(tài)下一般是非甲基化的，當(dāng)發(fā)生甲基化時(shí)，基因轉(zhuǎn)錄沉寂，使一些重要基因如抑癌基因、DNA修復(fù)基因等喪失功能，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞的生長分化調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時(shí)修復(fù)，這與多種腫瘤形成密切相關(guān)。第十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五DNA低甲基化：整個(gè)基因組普遍低甲基化，這種廣泛的低甲基化會(huì)造成基因的不穩(wěn)定，這與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。DNA的低甲基化也可能在異常組蛋白修飾的協(xié)同下引起某些T細(xì)胞基因的異常活化、導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。第十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五組蛋白修飾DNA以染色質(zhì)的形式存在，染色質(zhì)通常由DNA、組蛋白、非組蛋白以及少量RNA包裝而成，其中組蛋白是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)蛋白。組蛋白的N-末端可通過共價(jià)作用從而發(fā)生乙酰化、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻譯后的修飾，這些修飾的信息構(gòu)成了豐富的組蛋白密碼，其中乙?；图谆亲顬橹匾男揎椃绞?。第十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五組蛋白的不同修飾第十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五組蛋白乙酰化：組蛋白乙?；怯山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙酰基酶(HDAC)協(xié)調(diào)催化完成，修飾的部位一般位于N-末端保守的賴氨酸殘基上。組蛋白乙?；且粋€(gè)可逆的動(dòng)力學(xué)過程，可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。第十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五組蛋白甲基化：組蛋白甲基化多發(fā)生于組蛋白H3、H4的賴氨酸和精氨酸殘基上，由特異的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histonemethyltransferase,HMT)催化完成，也是一個(gè)可調(diào)控的動(dòng)態(tài)修飾過程。而組蛋白的去甲基化是由賴氨酸去甲基酶(lysine-specificdemethylase1,LSD1)催化完成。第十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五組蛋白的其他修飾：組蛋白泛素化由E1、E2、E3級(jí)聯(lián)酶催化修飾，也是一個(gè)可逆的動(dòng)力學(xué)過程。所有組蛋白的組分均能磷酸化。組蛋白的各種修飾不是相互獨(dú)立的，而是互相聯(lián)系的，例如H3-Serl0的磷酸化可以促進(jìn)H3-K14乙?；鳫3-K9的甲基化則會(huì)阻止H3-Serl0的磷酸化。第十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑(remodeling)染色質(zhì)重塑是指染色質(zhì)位置、結(jié)構(gòu)的變化，主要包括緊縮的染色質(zhì)在核小體連接處發(fā)生松動(dòng)造成染色質(zhì)的解壓縮，從而暴露了基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)中的順式作用元件，為反式作用因子的結(jié)合提供了可能。第十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五染色質(zhì)重塑與基因轉(zhuǎn)錄第十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五動(dòng)態(tài)的染色質(zhì)重塑過程是大多數(shù)以DNA為模板的生物學(xué)過程的基礎(chǔ)，如基因的轉(zhuǎn)錄、DNA的復(fù)制與修復(fù)等等，而這些生物學(xué)過程的混亂都與疾病的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)，因此染色質(zhì)重塑不僅能夠調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)還參與了與疾病發(fā)生密切相關(guān)的那些基礎(chǔ)細(xì)胞生理過程。但是不同的染色質(zhì)重塑能夠?qū)е虏煌募膊?，又提示我們這些生理過程并不是獨(dú)立的起作用。第二十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五非編碼RNA調(diào)控(ncRNA)功能性非編碼RNA在表觀遺傳修飾中發(fā)揮極其重要的作用。ncRNA按照大小可分為兩類：長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。長鏈非編碼RNA在基因簇乃至于整個(gè)染色體水平上發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用，短鏈RNA在基因組水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。第二十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五長鏈非編碼RNAX染色體的失活就是長鏈ncRNA所介導(dǎo)的甲基化和組蛋白修飾共同參與的一個(gè)復(fù)雜的過程。x染色體上的失活基因編碼出相應(yīng)RNA，這些RNA包裹在x染色體上，達(dá)到某一水平后，在甲基化和組蛋白修飾的參與下共同導(dǎo)致并維持x染色體的失活。此外長鏈ncRNA常在基因組中建立單等位基因表達(dá)模式，在核糖核蛋白復(fù)合物中充當(dāng)催化中心，對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變發(fā)揮著重要的作用。第二十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五短鏈非編碼RNA短鏈非編碼RNA(又稱小RNA)能夠介導(dǎo)mRNA的降解，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，決定著細(xì)胞的分化命運(yùn)，還對(duì)外源的核酸序列有降解作用以保護(hù)本身的基因組。短鏈非編碼RNA的表達(dá)與功能第二十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五RNA干擾(RNAInterference,RNAi)真核生物mRNA編碼區(qū)同源的外源雙鏈RNA(DoubleStrandRNA,dsRNA)能特異地誘導(dǎo)其同源mRNA的降解，導(dǎo)致相應(yīng)基因的沉默，這一現(xiàn)象被稱為RNA干擾，RNAi依賴于小干擾RNA(SmallInterferenceRNA,siRNA)與靶序列之間嚴(yán)格的堿基配對(duì)，具有很強(qiáng)的特異性。第二十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五miRNA真核生物體內(nèi)另一類重要的非編碼RNA就是miRNA。miRNA是一類長約為21~23nt的單鏈RNA分子，廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細(xì)胞中。miRNA的生成與功能第二十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五不同表觀遺傳學(xué)修飾之間的相互調(diào)控表觀遺傳修飾從多個(gè)水平上調(diào)控基因表達(dá)，而不同水平的調(diào)控之間也是相互關(guān)聯(lián)的，任何一方面的異常都可能影響到其他水平的表觀遺傳修飾。事實(shí)上不同水平的表觀遺傳修飾在真核細(xì)胞中構(gòu)成了一個(gè)完整的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。第二十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五最初認(rèn)為不同腫瘤細(xì)胞中的miRNA的表達(dá)異常是缺失或者突變的結(jié)果，但是一些最新研究顯示miRNA的表達(dá)也會(huì)受到甲基化和其他表觀遺傳機(jī)制的影響。miRNA的表達(dá)受甲基化和其他表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控siRNA誘導(dǎo)DNA的甲基化siRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平基因沉默是通過指導(dǎo)基因組表觀修飾完成的，包括指導(dǎo)基因組DNA甲基化和指導(dǎo)組蛋白修飾，siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化具有精確特定的靶向性，在某種程度上與腫瘤細(xì)胞中抑癌基因特定沉默過程有關(guān)。第二十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)表觀遺傳疾病DNA甲基化與疾病DNA甲基化與腫瘤腫瘤細(xì)胞中的DNA甲基化一般表現(xiàn)為總體的低甲基化水平和特定區(qū)域的高甲基化，這些變化可以同時(shí)發(fā)生在同一腫瘤組織內(nèi)?；蚩傮w甲基化水平降低導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因、細(xì)胞凋亡基因相應(yīng)的CpG島的甲基化沉默，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的形成。第二十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五腫瘤類型表觀遺傳修飾改變肺癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（p16INK4a、DAPK1、RASSF1A）、CBP基因組及染色體重組因子BRG1的缺失乳腺癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（BRCA1、E-cadherin、TMS1、雌激素受體）食管癌組蛋白去甲基基因JMJD2C/GASC1擴(kuò)增、CpG島高甲基化（p16INK4a、p14ARF）胃癌CpG島高甲基化（hMLH1、E-cadherin、p14ARF、p16INK4a）肝癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（SOCS1、GSTP1、）、癌基因的低甲基化（c-fos、c-jun、c-myc）結(jié)直腸癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（hMLH1、p16INK4a、RARB2、SFRP1、WRN）、miRNA高甲基化、IGF2印記作用丟失、組蛋白修飾突變（EP300和HDAC2）、單乙?；徒M蛋白H4環(huán)丙烷形式的降低腎癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（VHL）、IGF2印記作用丟失膀胱癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（p16INK4a、TPEF/HPP1）、miRNA高甲基化前列腺癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（GSTP1）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2基因擴(kuò)增；組蛋白H3和H4異常修飾、癌基因的低甲基化（k-ras）卵巢癌CpG島高甲基化（BRCA1）、微衛(wèi)星DNA低甲基化神經(jīng)膠質(zhì)瘤CpG島高甲基化（MGMT、EMP3和THBS1）淋巴瘤CpG島高甲基化（p16INK4a、p73和MGMT）、單乙?；徒M蛋白H4環(huán)丙烷形式的降低白血病CpG島高甲基化（p16INK4a、p15INK4b、EXT1和ID4、E-eadherin）、組蛋白修飾易位（CBP、MOZ、MORF、MLL1、MLL3和NSD1）不同腫瘤中表觀遺傳學(xué)修飾的異常變化第二十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五原癌基因(oncogene)：較低水平的原癌基因?qū)τ诩?xì)胞的生長、發(fā)育、分化和信號(hào)傳導(dǎo)都是必需的，當(dāng)發(fā)生突變或基因異常表達(dá)時(shí)癌癥就產(chǎn)生了。研究發(fā)現(xiàn)原癌基因通常在腫瘤新生物中呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。腫瘤抑制基因(tumorsuppressiongene)：腫瘤抑制基因的產(chǎn)物能夠抑制細(xì)胞的生長，失去其功能將促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；與原癌基因在激活方式上的不同在于腫瘤抑制基因的激活必須有等位基因的兩次突變或缺失。藥物：葉酸和維生素B12都是甲基的供體，能影響甲基化的狀態(tài)，主要是對(duì)全基因組甲基化上調(diào)的影響。環(huán)境因素：環(huán)境因素亦可影響腫瘤中基因的甲基化，從而間接的促進(jìn)或影響腫瘤的發(fā)生。第三十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五DNA甲基化與自身免疫性疾病DNA甲基化的改變可以影響一些與黏附分子和細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的基因，導(dǎo)致T細(xì)胞的自身反應(yīng)性改變，因此對(duì)維持T細(xì)胞的功能至關(guān)重要。研究證實(shí)，沒有維持DNA甲基化水平和模式的成熟T細(xì)胞，在體內(nèi)、外均能發(fā)生自身反應(yīng)性，因此表觀遺傳的失控可以引起自身免疫性疾病。第三十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五DNA甲基化與衰老DNA甲基化作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組修飾和表達(dá)調(diào)控的后遺傳方式，在細(xì)胞的衰老過程中總體水平下降，同時(shí)又伴隨著某些基因的高甲基化。永生化細(xì)胞基因組的甲基化水平較高，因此甲基化水平過高又是腫瘤細(xì)胞的表現(xiàn)。目前年齡相關(guān)的甲基化已作為細(xì)胞生命歷史的標(biāo)簽。第三十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五DNA甲基化與心血管疾病心血管疾病被認(rèn)為是受甲基化控制的人類重要疾病，對(duì)心血管疾病的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制深入研究，有利于制定心血管疾病的有效防御策略，同時(shí)DNA甲基化的可逆性，為采用控制飲食及其他環(huán)境手段干預(yù)心血管疾病的進(jìn)程提供了新的方法。第三十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五DNA甲基化與精神疾病1972年Gottesman就將外遺傳這一概念引入精神病遺傳學(xué)研究。近些年當(dāng)傳統(tǒng)遺傳研究在精神疾病的研究中困難重重時(shí)，外遺傳與精神疾病尤其是DNA甲基化與精神分裂癥的關(guān)系，引起了研究者的重視。雖然目前還處于假說階段，但不少研究已提示DNA甲基化參與了精神分裂癥的發(fā)生。第三十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑與疾病染色質(zhì)重塑復(fù)合物、組蛋白修飾酶的突變均與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA甲基化、DNA重組、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和修復(fù)的異常相關(guān)，這些異常可以引起生長發(fā)育畸形，智力發(fā)育遲緩，甚至導(dǎo)致癌癥。第三十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五染色質(zhì)重塑異常引發(fā)的疾病是由于重塑復(fù)合物中的關(guān)鍵蛋白突變導(dǎo)致染色質(zhì)重塑失敗，即核小體不能正確定位，并使DNA損傷修復(fù)復(fù)合物，基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置等不能接近DNA，影響基因的正常表達(dá)。如果突變導(dǎo)致抑癌基因或調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白出現(xiàn)異常將導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。乙?；傅耐蛔儗?dǎo)致正?；虿荒鼙磉_(dá)，去乙?；富蛞恍┤ヒ阴；赶嚓P(guān)蛋白的突變使去乙?；稿e(cuò)誤募集將引發(fā)腫瘤等疾病。第三十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五基因組印記與疾病基因組印記是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時(shí)發(fā)生了修飾，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達(dá)特性，這種修飾常為DNA甲基化修飾，也包括組蛋白乙?；?、甲基化等修飾。第三十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五目前發(fā)現(xiàn)的印記基因大約80%成簇，這些成簇的基因被位于同一條鏈上的順式作用位點(diǎn)所調(diào)控，該位點(diǎn)被稱做印記中心(imprintingcenter,IC)。印記基因異常表達(dá)引發(fā)伴有復(fù)雜突變和表型缺陷的多種疾病，許多印記基因?qū)ε咛ズ吞撼錾蟮纳L發(fā)育調(diào)節(jié)非常重要，對(duì)行為和大腦功能也有很大影響，印記基因的異常同樣可誘發(fā)癌癥。第三十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五X染色體失活與疾病女性有兩條X染色體，男性只有一條X染色體，為保持平衡，女性一條X染色體被永久失活——“劑量補(bǔ)償”效應(yīng)。X染色體隨機(jī)失活是X失活中心(Xinactivationcenter,Xic)調(diào)控的。X染色體失活相關(guān)疾病多是由X染色體不對(duì)稱失活使攜帶有突變等位基因的X染色體在多數(shù)細(xì)胞中具有活性所致。第三十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五非編碼RNA與疾病ncRNA對(duì)細(xì)胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用，而它們在腫瘤發(fā)生過程中的作用機(jī)制正在逐漸被認(rèn)識(shí)。其中miRNA能夠調(diào)控那些與發(fā)育、增殖、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，而且它們的表達(dá)異常是人類惡性腫瘤的一個(gè)共同特征。第四十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五人們對(duì)于表觀遺傳過程的關(guān)注程度日益增強(qiáng)，以DNA甲基化和組蛋白修飾為靶向的治療方法也初露端倪；在表觀遺傳修飾分析技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)之上，我們可以進(jìn)一步了解表觀遺傳過程的機(jī)制并設(shè)計(jì)出針對(duì)這一過程的治療性干預(yù)手段。第四節(jié)表觀遺傳學(xué)研究技術(shù)第四十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五DNA甲基化的檢測基因組整體水平的甲基化分析高效液相色譜柱相關(guān)方法高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖最明顯優(yōu)點(diǎn)在于,可用于高通量混合樣本的檢測，能明確顯示目的基因組整體甲基化的水平，缺點(diǎn)：不能定位具體的甲基化位點(diǎn)。第四十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法缺點(diǎn)：SssI甲基轉(zhuǎn)移酶不穩(wěn)定，結(jié)果不夠精確。氯乙醛法該法可以直接測定基因組整體的5mC水平，優(yōu)點(diǎn)：所使用的試劑價(jià)格低廉且穩(wěn)定性好，可以避免放射性污染，缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且氯乙醛為有毒物質(zhì)。第四十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五基因特異位點(diǎn)的甲基化分析甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法該方法是一種經(jīng)典的甲基化研究方法，優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)檢測基因組內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)。易解釋，成本低廉。缺點(diǎn)：由于CG不僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；只有檢測與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測方法的結(jié)果才有意義；樣本量大；存在酶消化不完全引起假陽性的問題；不適用于混合樣本。第四十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五直接測序法重亞硫酸鹽處理示意圖該方法可靠性和精確度均較高，能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，但是需要大量的克隆測序，操作過程繁瑣且費(fèi)用昂貴。第四十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五甲基化特異性的PCR法優(yōu)點(diǎn)：避免了使用限制性內(nèi)切酶及相關(guān)問題；敏感性高，可用于石蠟包埋樣本。缺點(diǎn)：對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求高，可靠的引物需設(shè)計(jì)包含兩或多個(gè)完全甲基化或非甲基化位點(diǎn)，限制了該方法的應(yīng)用；只能作定性研究，不能作定量檢測；重亞硫酸鹽處理不完全導(dǎo)致結(jié)果假陽性。甲基化特異性的PCR示意圖第四十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五甲基化敏感性單核苷酸引物延伸法優(yōu)點(diǎn)：可以檢測特異位點(diǎn)甲基化情況且不受內(nèi)切酶限制；通過設(shè)計(jì)不同的引物可在同一延伸反應(yīng)中得到不同位點(diǎn)甲基化的情況；可檢測甲基化位點(diǎn)分布不均的樣本；能夠定量檢測甲基化水平；僅需少量的DNA，且可用于石蠟包埋樣本。缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)步驟略復(fù)雜，檢測多位點(diǎn)時(shí)需設(shè)計(jì)多個(gè)引物，不能對(duì)較長序列進(jìn)行全面檢測；存在放射性污染及重亞硫酸鹽處理不完全的問題。第四十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)簡單，不需預(yù)先知道位點(diǎn)及樣本序列；可進(jìn)行定量研究；檢測所需的樣本量較少，可用于石蠟包埋樣本。缺點(diǎn)：只能獲得特殊酶切位點(diǎn)甲基化情況，因此陰性檢測結(jié)果不能排除樣品中甲基化存在的可能；由于限制性內(nèi)切酶和PCR的使用，序列分析受到限制。第四十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析優(yōu)點(diǎn)：可用于等位基因甲基化分析；能提示甲基化狀態(tài)分布的不均性。缺點(diǎn)：只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區(qū)分開，而水平較低的不易分開，有時(shí)會(huì)因?yàn)榧谆稽c(diǎn)的隨機(jī)和不均勻分布導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)擁擠、拖尾的現(xiàn)象，故敏感性及準(zhǔn)確性略低；檢測的片段不宜過長。第四十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：可以用來檢測出除最高溫度解鏈區(qū)域以外的所有發(fā)生甲基化的DNA片段，所需的樣品量少，能較直觀的顯示出甲基化情況。缺點(diǎn)：解鏈溫度和DGGE的變性濃度梯度需要摸索。第五十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五甲基化敏感性解鏈曲線分析最大的優(yōu)點(diǎn)：能夠?qū)谆植疾痪鶆虻腄NA樣本進(jìn)行半定量分析。缺點(diǎn)：不能夠精確檢測出甲基化的具體位點(diǎn)；研究序列的長度不宜過長；對(duì)低水平的DNA甲基化敏感性低。第五十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五Methylight優(yōu)點(diǎn)：高敏感、快速，非甲基化等位基因比例很高也能精確地檢測出甲基化的等位基因，可做多樣本、多位點(diǎn)分析，具備可重復(fù)性，所需的樣本量少，不需電泳分離，能夠?yàn)榕R床樣本的研究提供可靠的技術(shù)支持。缺點(diǎn)：測定每個(gè)位點(diǎn)都要用一對(duì)引物和探針，費(fèi)用高且受較多因素的影響。DNA微陣列法優(yōu)點(diǎn)：可用于多樣本、多位點(diǎn)甲基化的檢測，檢測所需的樣本量少，適于臨床樣本；缺點(diǎn)：不能得到每個(gè)位點(diǎn)的信息，探針可能存在交叉雜交致結(jié)果假陽性，因此該方法進(jìn)行檢測時(shí)一定要設(shè)立對(duì)照。第五十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五甲基化敏感性斑點(diǎn)分析優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、易于掌握，能夠一次檢測多種樣本，包括石蠟包埋樣本。缺點(diǎn)：檢測序列不能過長；若探針錯(cuò)誤雜交或重亞硫酸鹽處理不完全，則可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。第五十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五MS-MLPA優(yōu)點(diǎn)：所需的樣本量少，由于探針具有非常短的識(shí)別序列，因此可以用于局部降解的DNA，如石蠟包埋的樣本；可用于分析大量的混合樣本，可一次檢測多個(gè)靶基因中位點(diǎn)的甲基化情況。缺點(diǎn)：探針連接位點(diǎn)受限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)識(shí)別的限制，且要考慮到所用酶的反應(yīng)適宜溫度。第五十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五新甲基化位點(diǎn)的篩查限制性標(biāo)記基因組掃描優(yōu)點(diǎn)：可一次得到多個(gè)位點(diǎn)甲基化的情況，利于新甲基化位點(diǎn)的尋找。缺點(diǎn)：RLGS圖譜不能完全確認(rèn)缺失的片段是由于甲基化還是由于樣本本身缺失所致；對(duì)DNA質(zhì)量要求高；結(jié)果復(fù)雜，不易解釋。MBD柱層法優(yōu)點(diǎn)：高通量，可對(duì)未知片段進(jìn)行初篩，選出含有甲基化的片段進(jìn)一步檢測，快速、簡便。缺點(diǎn)：DNA片段的特殊構(gòu)型也可與MBD柱相結(jié)合，造成非特異性捕獲引起假陽性；是一種定性而非定量的方法；由于MBD柱中所含多肽的量不完全相同，因此不同的MBD柱或多次使用的MBD柱的結(jié)果可能存在差異。第五十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五COMPARE-MS該方法聯(lián)合運(yùn)用了MBD柱層法及MS-RE法，避免了單用MBD時(shí)非特異性捕獲及單用內(nèi)切酶時(shí)不完全消化所致的假陽性。在快速、簡便同時(shí)，保證了結(jié)果的特異性和敏感性。缺點(diǎn)：需要使用限制性內(nèi)切酶，因此不同程度地受到內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的限制。第五十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑的檢測染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)是研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具。它可以靈敏地檢測目標(biāo)蛋白與特異DNA片段的結(jié)合情況，還可以用來研究組蛋白與基因表達(dá)的關(guān)系。根據(jù)“組蛋白密碼”學(xué)說，組蛋白的各種共價(jià)修飾的組合會(huì)以協(xié)同或拮抗的方式誘導(dǎo)特異的下游功能，因此染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)也為研究組蛋白修飾在基因表達(dá)中的作用，全面闡明真核基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具。第五十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五基本原理：生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲破碎將染色質(zhì)隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)片段，用所要研究的目的蛋白的特異性抗體沉淀交聯(lián)復(fù)合體，再經(jīng)過蛋白質(zhì)與DNA解除偶聯(lián)，最后純化目的片段并檢測。主要步驟：A.細(xì)胞固定；B.超聲破碎斷裂染色質(zhì)；C.染色質(zhì)的免疫沉淀；D.解除交聯(lián)和純化DNA；E.DNA的檢測。第五十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合芯片分析技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀與芯片相結(jié)合技術(shù)(ChIP-on-chip)，成為研究目的蛋白質(zhì)與全基因組中DNA相互作用位點(diǎn)的一種全基因組定位分析方法第五十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五基本原理：生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)在一起，超聲波將其打碎為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過所要研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體沉淀該復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，解交聯(lián)；用LM-PCR擴(kuò)增富集的DNA片段并用熒光染料Cy5進(jìn)行標(biāo)記；未經(jīng)免疫沉淀富集的DNA片段也用LM-PCR擴(kuò)增，但用另一種染料Cy3標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，將兩組標(biāo)記DNA與一張含有全基因組序列的DNA芯片進(jìn)行雜交，從而大規(guī)模挖掘相關(guān)順式調(diào)控元件，高通量地篩選已知蛋白質(zhì)的未知DNA靶點(diǎn)與反式作用因子在整個(gè)基因組上的分布情況。第六十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五全基因組定位技術(shù)全基因組定位技術(shù)(GMAT)是一種將染色質(zhì)免疫沉淀和基因表達(dá)系列分析相結(jié)合的方法。它通過快速、詳細(xì)地分析成千上萬個(gè)EST來尋找表達(dá)豐度不同的SAGE標(biāo)簽序列來獲得全基因組水平上的表達(dá)信息?；驹恚菏紫扔每鼓撤N修飾組蛋白尾端的抗體進(jìn)行ChIP，獲得細(xì)胞中與這種修飾的組蛋白相結(jié)合的全部DNA片段；然后利用SAGE技術(shù)構(gòu)建文庫并進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析，從而獲得這種組蛋白在全基因組中分布狀況的信息。第六十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五非變性染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)非變性染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(nChIP)利用微球菌核酸酶把染色質(zhì)消化成碎片，使用相應(yīng)的抗體將含有蛋白或者修飾后蛋白的染色質(zhì)片斷進(jìn)行免疫選擇。nChIP分為三個(gè)階段：染色質(zhì)制備；免疫沉淀；DNA和蛋白質(zhì)的分析。第六十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五nChIP主要具有三個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：可以通過蔗糖梯度純化微球菌核酸酶處理所得到的單個(gè)核小體作為實(shí)驗(yàn)所需的染色質(zhì)，從而做到單核小體水平上的高分辨率定位；免疫沉淀所得到的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以直接通過考馬斯亮藍(lán)染色的聚丙烯酰胺電泳檢測免疫沉淀的效率，沒有甲醛交聯(lián)這一步，可以在不改變蛋白質(zhì)電荷的情況下恢復(fù)其狀態(tài)，因而適于用酸-尿素-Triton膠來檢測多方面的數(shù)據(jù)；nChIP實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)準(zhǔn)備階段中所丟失的蛋白質(zhì)可能有助于對(duì)附著有轉(zhuǎn)錄因子的修飾后核小體的研究。第六十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五染色質(zhì)的構(gòu)型研究DNaseⅠ高敏感性分析局部能轉(zhuǎn)錄的DNA形成能夠結(jié)合DNaseⅠ的構(gòu)象的特性，是的DNaseⅠ高敏性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(3C)交聯(lián)DNA片段之間的連接條件要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于隨機(jī)片段，故通過PCR可定量分析兩特定限制片段的交聯(lián)頻率，或兩個(gè)基因位點(diǎn)相互作用的頻率。三維熒光原位雜交技術(shù)高分辨率的三維熒光原位雜交技術(shù)(3DFISH)實(shí)現(xiàn)了染色體組空間結(jié)構(gòu)和核內(nèi)不同染色質(zhì)區(qū)的分析。第六十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五miRNA的檢測與功能分析miRNA基因鑒定miRNA具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物特性：成熟miRNA長度為21~23nt左右，可以利用RNA雜交分析或其它的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定，比如從小RNA文庫直接克隆得到；miRNA前體具有發(fā)夾或折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不含大的內(nèi)部環(huán)狀結(jié)構(gòu)和突起，且成熟的miRNA應(yīng)位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸部；成熟的miRNA由Dicer加工而成，伴隨Dicer功能活性的減少，可以檢測到生物體中前體的積聚；成熟miRNA的序列和預(yù)測的發(fā)夾結(jié)構(gòu)在不同物種間是保守的。第六十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五迄今為止，miRNA獲取的方法主要包括兩種：直接從總RNA中克隆出小RNA，再根據(jù)生物信息學(xué)方法排除不符合miRNA結(jié)構(gòu)的小RNA；以結(jié)構(gòu)特征為基準(zhǔn)，利用計(jì)算機(jī)輔助篩選法選出miRNA候選基因，再通過實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。第六十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五正向、反向遺傳學(xué)分析方法正向遺傳學(xué)分析方法的原理是：把突變的基因從產(chǎn)生非正常表型的生物體或者組織當(dāng)中分離出來，進(jìn)行研究鑒定。反向遺傳學(xué)分析方法的原理是：在體外引入特定的突變，例如定位誘變法，然后把已突變的基因放回到原來的宿主當(dāng)中，而且常常是通過同型基因化或換位放回到宿主中原來的位置上，從而觀察表型的改變。第六十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五基因組實(shí)驗(yàn)方法該方法鑒定miRNA基因需要制備小RNA的cDNA文庫。計(jì)算機(jī)預(yù)測法主要依據(jù)：首先，發(fā)夾結(jié)構(gòu)是miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本特性，所有的預(yù)測法都需要考慮這一原則；其次，是依據(jù)miRNA序列和結(jié)構(gòu)的保守性，這是區(qū)分miRNA候選基因和其它不相關(guān)發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列關(guān)鍵因素；最后，根據(jù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性和序列、結(jié)構(gòu)的相似性，或者利用相關(guān)已知miRNA的遺傳座位進(jìn)行預(yù)測新的miRNA。第六十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期五miRNA靶標(biāo)的鑒定miRNA靶標(biāo)鑒定高效性影響因素第一，在動(dòng)物中miRNA與靶基因mRNA以不精確的堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合于3’UTR。第二，miRNA是序列短小的小分子，與3’UTR結(jié)合的方式存在多樣性。另外，結(jié)合位點(diǎn)除了配對(duì)區(qū)還存在突環(huán)和錯(cuò)配區(qū)，這也給分析軟件準(zhǔn)確性帶來障礙。第三，理論上預(yù)測出的靶標(biāo)假陽性現(xiàn)象比較嚴(yán)重。第四，在進(jìn)化過程