分子生物學(xué)DNA復(fù)制

分子生物學(xué)DNA復(fù)制第一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)遺傳物質(zhì)特性第二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五嘧啶Pyrimidines嘌呤Purines

多聚核苷酸的化學(xué)本質(zhì)☉堿基NitrogenousbasesUracil(U)第三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五☉核糖

Thesugarsofnucleicacids第四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五☉核苷（nucleotide）嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子核糖是戊糖RNA－核糖核苷(R=OH)DNA－脫氧核糖核苷(R=H)1’9糖苷鍵Glycosidicbond第五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五☉核苷酸（nucleotideacid）核苷的磷酸酯脫氧核糖核苷酸核糖核苷酸其中α和β、β和γ之間是高能磷酸鍵αβγdATPdNTPCMPNMP第六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)DNA結(jié)構(gòu)第七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五一、DNA分子的一級結(jié)構(gòu)(DNAsequence)

多聚核苷酸鏈

主鏈?zhǔn)呛颂呛土姿醾?cè)鏈為堿基由3’,5’磷酸二酯鍵連接

鏈的方向：同一個磷酸基的3’酯鍵到5’酯鍵的方向

(5’→3’)5’-UCAGGCUA-3’=UCAGGCUA

默認(rèn)書寫順序5‘→3’3’5’第八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五DNA一級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)

a、脫氧核糖是其顯著特點(diǎn)－－－－DNA極其穩(wěn)定的根本原因酮式烯醇式酮式烯醇式

DNA在酸性條件下的穩(wěn)定性？！第九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五RNA在高pH時則穩(wěn)定性很差

——由于2’－OH導(dǎo)致的水解OH自由的5’-OH2’,3’-環(huán)式單核苷酸堿如：<37℃,0.3MKOH,1h12-18h第十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

b、磷酸呈四面體構(gòu)型，脫氧核糖呈折疊的五元環(huán)，堿基是平面的第十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五C、主鏈?zhǔn)怯H水的，側(cè)鏈（堿基）是疏水的

主鏈的脫氧核糖的羥基能與水形成氫鍵，而磷酸基團(tuán)在生理?xiàng)l件下離解為負(fù)離子

這些特點(diǎn)保證了多核苷酸鏈可形成穩(wěn)定的構(gòu)象

一級結(jié)構(gòu)的概念指DNA分子中的核苷酸排列順序，通過3’,5’-磷酸二酯鍵相連形成的線形結(jié)構(gòu)

不同生物借此貯存遺傳信息決定DNA的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)第十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五二、DNA雙螺旋模型結(jié)構(gòu)（doublehelixmodel）1.雙螺旋結(jié)構(gòu)提出背景依據(jù)a、1938.W.T.Astbury首次用X－射線分析DNAb、1950ChargaffA+G/T+C=1A+T≠G+Cc、1952AlexanderTodd

發(fā)現(xiàn)了核苷酸和核苷酸之間由磷酸二酯鍵聯(lián)接d、1952M.H.F.Wilkins&RosalindFranklin

得到了高度定向的DNA纖維的X-射線照片發(fā)現(xiàn)原子長軸存在0.34和3.4nm兩種周期性

此外，之前的密度測定表明螺旋由兩條多核苷酸鏈組成，且直徑恒定（2nm)。第十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五DNA結(jié)構(gòu)的3種模型1953.Watsosn&Crick

第十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五2.雙螺旋的主鏈每一單鏈具有5‘→3’極性

兩條單鏈極性相反反向平行兩條單鏈間以氫鍵連接第十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五C-GT-A

堿基互補(bǔ)第十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五以中心為軸，向右盤旋（直徑2nm）堿基是扁平結(jié)構(gòu)，位于內(nèi)部，成對且垂直于螺旋軸雙螺旋中存在大，小溝第十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五第十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五·直徑20?3.雙螺旋模型參數(shù)·螺距為34?（任一條鏈繞軸一周所升降的距離）·每圈有10個核苷酸（堿基）·有大溝和小溝配對堿基并不充滿雙螺旋空間，且堿基對占據(jù)的空間不對稱

·兩個堿基之間的垂直距離是3.4?。螺旋轉(zhuǎn)角是36度第十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五Pitch34?Rise3.4?Width20?MajorGrooveMinorGroove10.4bp/turn第二十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五?大、小溝的差異⊕大溝中堿基差異容易識別,往往是蛋白質(zhì)因子結(jié)合特異DNA序列的位點(diǎn)⊕小溝相對體現(xiàn)的信息較少

O,N:氫鍵受體aNH2：氫鍵供體d大溝(a-d-a)小溝（a-a）大溝(a-a-d,d-a-a)小溝（a-d-a）第二十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五4.雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本形式ABZHandednessBaseInclination第二十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五ABZ大溝寬小溝窄小溝窄大溝窄深小溝寬淺大溝不存在小溝窄而深第二十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

表2.1

A、B及Z型螺旋的主要特征概括

A型

B型

Z型

螺旋方向

右手

右手

左手

直徑

約2.6nm

約2.0nm

約1.8nm

每匝螺旋堿基數(shù)（n）

11

10

12（6個二聚體）

每對堿基旋轉(zhuǎn)角度（360/n）

33?

36?

60?

每對堿基螺旋上升（h）

0.26nm

0.34nm

0.37nm

螺距

2.8nm

3.4nm

4.5nm

堿基對與中心軸傾角

20?

6?

7?

大溝

乍，深

寬，深

平坦

小溝

寬，淺

乍，深

乍，深

糖苷鍵

anti

anti

anti（嘧啶）

syn（嘌呤）

序列

Any

Any

嘌呤、嘧啶交替排列

存在的條件

DNA-Na

crytic

D.SRNA

DNA/RNA

Normal

4M

Na+

第二十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五三、超螺旋（superhelixORsupercoil）

最早在SV40和多瘤病毒中發(fā)現(xiàn)

超螺旋是所有線性或環(huán)形DNA的共有的重要特征ThesupercoilsoftheSV40minichromosomecanberelaxedtogenerateacircularstructure,whoselossofhistonesthengeneratessupercoilsinthefreeDNA.第二十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

超螺旋結(jié)構(gòu)的方向性B-DNA緊纏overwinding(右旋)

正超螺旋（positivesupercoiled

）導(dǎo)致左手超螺旋第二十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五B-DNA松纏unwinding(左旋)

負(fù)超螺旋（NegativeSupercoiled

）導(dǎo)致右手超螺旋第二十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

所有生物的DNA幾乎有5%為NegativeSuperhelix?!第二十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

超螺旋狀態(tài)的描述數(shù)學(xué)公式描述Vinograd方程式L=T+W(α=β+γ)L

連接數(shù)（Linkingnumber）

cccDNA分子兩鏈的交叉數(shù)T

盤繞數(shù)（Twistingnumber）雙鏈DNA的纏繞數(shù)，初級螺旋圈數(shù)W超螺旋數(shù)（Writhingnumber）直觀上為雙螺旋在空間的轉(zhuǎn)動數(shù)W=負(fù)值（negativesuperhelix）W=正值(positivesuperhelix）

第二十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五第三十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五InvitroEBinsertedNeg.→Pos.Superhelixchangebasebase3.4埃EB7.0埃basebasebasebase局部DNA的緊縮體外可產(chǎn)生正超螺旋360o-26o/helix/OneofEBinsertedcccDNA第三十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五不同構(gòu)型的DNA沉降系數(shù)和遷移率不同LinearDNA.

LOpenCircleDNA

OC

relexedformSupercoiledcircle(高級結(jié)構(gòu))CovalentClosedCircle

CCCD.S.L1.00D.S.OC1.14S.S.L1.30D.S.CCC1.41Collapsed3.00SvedbergUnit(S)polymerOCLCCC第三十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五負(fù)Superhelix

OC,L,DNA

正Superhelix

EB對超螺旋結(jié)構(gòu)的影響L(linkingNum.)不變T(TwistingNum.)減少(-26o/helix/0neofEBinserted)

L=T+WW=L-T=正值DNA向緊縮方向發(fā)展00.050.1第三十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

第三節(jié)DNA的物理、化學(xué)性質(zhì)第三十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五一、DNA分子變性(DNAdenaturation)D.S.DNAS.S.DNA

加熱,極端pH,有機(jī)溶劑（尿素、酰胺)，低鹽濃度等1、條件：第三十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五2、變性過程的表現(xiàn)

¤

是一個爆發(fā)式的協(xié)同過程，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍

¤導(dǎo)致一些理化性質(zhì)發(fā)生劇烈變化※熔液黏度降低

※沉降速度加大

※浮力密度上升

※此外吸收值升高（A260nm），即增色效應(yīng)指在DNA變性的過程中，在260nm的吸收值先是緩慢上升，達(dá)到某一溫度時及驟然上升第三十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五1.1851.01.37OD℃Concentration50μg/mlOpeticalDensity

D.SDNAA260=1S.SDNAA260=1.37dNTPsA260=1.60

=OD增加值的中點(diǎn)溫度(一般為85-95℃)

Tm

(meltingtemperature)

=midpointofthetemperaturerangeoverwhichDNAisdenatured第三十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

Marmur-Dotyformula

EvaluationGC%ofDNA

Tm=69.3+0.41×GC%

1xSSCGC%=30-70%(0.15MNacl+0.015MSodiumLimonate)Tm1

＜

Tm2℃1.01.1851.37ODwhatismeaning?第三十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五注意事項(xiàng):①DNA的GC含量同樣影響其密度第三十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五②OD260的應(yīng)用：

DNA或RNA的定量

OD260=1.0相當(dāng)于

50μg/ml雙鏈DNA

40μg/ml單鏈DNA

33μg/ml寡核苷酸判斷核苷酸樣品的純度

DNA純品：OD260/OD280=1.8

RNA純品：OD260/OD280=2.0第四十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五3、影響Tm值的因素

（1）在A,T,C,G隨機(jī)分布的情況下，決定于GC含量

（2）GC%含量相同的情況下GC%愈高→Tm值愈大；GC%愈低→Tm值愈小

AT形成變性核心，變性加快，Tm值小

堿基排列對Tm值具有明顯影響5`GC3`CGn＞＞5`CG3`GCn5`TA3`ATn＜＜5`AT3`TAn36.7℃57.02℃

Tm136.12℃72.55℃

第四十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

※

嘌呤嘧啶的排列順序?qū)﹄p螺旋結(jié)構(gòu)（穩(wěn)定性）的影響Pyrimidine-PurineStepsHaveLittleBaseStacking5’3’3’5’CGAT5’CA3’3’GT5’第四十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五Purine-PyrimidineStepsHaveExtensiveBaseStacking5’3’3’CATG5’5’AC3’3’TG5’第四十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五生物體內(nèi)僅UAA為最有效的終止密碼子

因?yàn)椋篣AAAUU

的Tm值是最低的一個，即使生理溫度下也不穩(wěn)定第四十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（3）大片段D.SDNA分子之間比較片段長短對Tm值的影響較小,與組成和排列相關(guān)（4）小于100bp的D.SDNA分子比較片段愈短，變性愈快，Tm值愈?。?）變性液中含有尿素，甲酰胺等尿素，甲酰胺與堿基間形成氫鍵改變堿基對間的氫鍵

Tm值可降至40℃左右

第四十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五（6）鹽濃度的影響

單鏈DNA主鏈的磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的靜電斥力兩條單鏈DNA的分離

Na+在磷酸基團(tuán)周圍形成的電子云對靜電斥力產(chǎn)生屏蔽作用減弱靜電斥力第四十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五Tm↑當(dāng)Na+濃度低屏蔽作用小斥力加強(qiáng)Tm↓

靜電斥力

熵值（△S）TmODA260

0.01M0.1M1.0MNa+當(dāng)Na+濃度高

屏蔽作用大斥力減弱熵值(△S)上升堿基溶解性降低疏水作用力增加第四十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五pH~12酮基→烯醇基pH~2-3NH2→NH2+(質(zhì)子化)

改變氫鍵的形成與結(jié)合力（7）極端pH條件的影響一切減弱氫鍵，堿基堆積力的因素均將使Tm

值降低第四十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五4、常用的變性方法☆熱變性

☆堿變性應(yīng)用廣泛，特別是用于變性動力學(xué)研究缺點(diǎn)：高溫引起磷酸二酯鍵的斷裂，得到長短不一的單鏈pH11.3時，全部氫鍵被淘汰無熱變性的缺點(diǎn)，為制備單鏈DNA的首選方法

◎保存單鏈DNA的條件

保持pH大于11.3

鹽濃度低于0.01mol/L第四十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五D.SDNAS.SDNADenaturation▲▼Renaturation

復(fù)性過程依賴于單鏈分子間的隨機(jī)碰撞

(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)

二、DNA分子的復(fù)性（annealorrenaturation）第五十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五影響DNA復(fù)性過程的因素：

陽離子濃度0.18~0.2MNa+

可消除polydNt間的靜電斥力

復(fù)性反應(yīng)的溫度低于Tm值25℃左右(60-65℃)

S.S,DNA的初始濃度C0

DNA分子中,dNt的排列狀況(隨機(jī)排列,重復(fù)排列)

S.S.DNA分子的長度（片段的大?。㏒.S.DNA愈長S.S.DNA愈短→分子擴(kuò)散愈慢→復(fù)性愈慢→分子擴(kuò)散愈快→復(fù)性愈快第五十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五3’-ATCTATGCTGTCAT-5’5‘-TAGATACGACAGTA-3’5‘-TAGATACGACAGTA-3’3’-ATCTATGCTGTCAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’第五十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五三、MolecularHybridization

(核酸,蛋白質(zhì)分子雜交)第五十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五1、定義(核酸分子雜交，“DNA印跡雜交”)

不同來源的單鏈DNA與單鏈DNA、RNA與單鏈DNA分子間在長于20bp的同源區(qū)域內(nèi)以氫鍵連接方式互補(bǔ)配對形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)的過程用途檢測DNA的缺失、插入，考察不同生物種類在進(jìn)化中的關(guān)系第五十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五第五十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五2、分子雜交的檢測D.S.DNAX-filmColumnabsorbD.SDNAp32orbiotinlabeledS.S.DNA(asprobe)×→S.S.DNAS.S.RNA顯微鏡觀察或放射自顯影第五十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五3、雜交形式固相雜交（濾膜）液相雜交固相分子雜交

類型

（1975E.M.Southern）

放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交－＋第五十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五SouthernBlotting的過程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測）5.結(jié)果檢測第五十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五傳統(tǒng)和現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)示意圖原位雜交/平板雜交Southern/Northern

點(diǎn)雜交Southern/Northern雜交Western雜交微孔板雜交第五十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五DIG分子示意圖第六十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五學(xué)生雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果JM83DNA(EcoRV)JM83DNA(BglI)JM83DNA(NcoI)pMD-phoAlasmidDNA(BamHI/PstI)M.MarkerDIG分子雜交轉(zhuǎn)膜第六十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

1975E.M.Southern

1977.

J.C.Alwine

1978.

HanyTowbinNorthernblotWesternblotS.S.RNA×S.S.DNAProtein(antigen)×antibodySouthernblotS.S.DNA×S.S.DNA＊原位分子雜交(Insituhybridization)

第六十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五Western印跡（免疫印跡）第六十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)原位雜交第六十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五InsituhybridizationLocalizationofDNALocalizationofRNA第六十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五SouthernblotNorthernblotWesternblotFISH第六十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五四、基因組的大小和C值悖理☆基因組（genome）：是指細(xì)胞或生物體的全套遺傳物質(zhì)，即某物種單倍體細(xì)胞所具有的遺傳信息的總和。

比如人基因組的全長為大約3×109對堿基，編碼3-4萬個蛋白分子細(xì)菌或噬菌體、病毒－－－單個染色體中所含的全部基因（DNA）第六十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五☆C值（C-value）：在真核生物中，每種生物的單倍體基因組的DNA總量總是恒定的，稱為C-值

【C-valueisthequantityofDNAinthegenome(perhaploidsetofchromosomes).】C是每種生物的一個特征，不同生物之間差別很大低等真核生物中與形態(tài)學(xué)復(fù)雜程度相關(guān)，但高等真核生物中變化很大DNAcontentofthehaploidgenomeisrelatedtothemorphologicalcomplexityoflowereukaryotes,butvariesextensivelyamongthehighereukaryotes.第六十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五第六十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五之一：物種之間形態(tài)學(xué)的復(fù)雜性與C值不成正相關(guān)b、親緣關(guān)系相近的生物大C值相差較大之二：一種生物內(nèi)大C值與編碼蛋白質(zhì)的基因相差極大

(Euk.人體c=C/10)(Prok.Φx174c＞C)

C值矛盾（C-valueparadox，C-悖理）：形態(tài)學(xué)的復(fù)雜程度與C-值不一致的現(xiàn)象a、生物進(jìn)化程度與C－值的矛盾(兩棲類與哺乳類)☆C值悖理與表現(xiàn)第七十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

第四節(jié)真核生物DNA序列類型第七十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五一、高度重復(fù)序列（Highlyrepetitivesequence）ProkaryoteEukaryote(GC%)42413455MOUSE

CALFCsCl離心

衛(wèi)星DNA（SatelliteDNA）第七十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五

由2-20bp組成重復(fù)單位串排列分布于著絲點(diǎn),端粒區(qū),結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)

heterochromatin第七十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五果蠅（Drosophila）衛(wèi)星DNASeacrab2bpATATAT…..Drosophila5bpATAATATAAT…..Mouse9bpGAAAAATGAGAAAAATGA第七十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五小衛(wèi)星重復(fù)單位小于25bp，重復(fù)次數(shù)為5-50次，長度達(dá)1－5kb。數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)或(Variablenumbertandemrepeats.VNTR)

☆小衛(wèi)星MinisatelliteDNA小衛(wèi)星DNA主要存在于端粒和著絲粒區(qū)。每個小衛(wèi)星區(qū)重復(fù)序列的拷貝數(shù)是高度可變的，因此常用DNA指紋技術(shù)作個體鑒定。第七十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五限制性內(nèi)切核酸酶概念限制性內(nèi)切酶可以將DNA剪切成特定的片段使用不同的限制性內(nèi)切酶，通過疊加法可用于DNA作圖第七十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五Southern印記限制性片斷長度多態(tài)性技術(shù)

(RFLP)—第一代DNA指紋技術(shù)DNA指紋技術(shù)HaeⅢ切某一個體DNA電泳(Electrophorese)與標(biāo)記的小衛(wèi)星DNA探針雜交X線膠片檢測第七十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期五限制性片斷長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)—第一代