小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌

食品衛(wèi)生微生物學檢驗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗范圍本標準適用于食品和食源性疾病樣品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢驗。標準性引用文件以下文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。但凡注日期的引用文件，其隨后全部的修改單(不包括訂正的內(nèi)容)或均不適用于本標準，然而，鼓舞依據(jù)本標準達成協(xié)議的各方爭論是否可使用這些文件的最版本。但凡不注日期的引用文件，其最版本適用于本標準。GB／T4789.4食品衛(wèi)生微生物學檢驗沙門氏菌檢驗設備和材料除微生物試驗室常規(guī)無菌及培育設備外，其他設備和材料如下：3.1 冰箱：2℃～5℃。3.2 恒溫培育箱：26℃±l℃、36℃±l℃。3.3 顯微鏡：l0×～l00×。均質(zhì)器或滅菌乳缽。0.1g。滅菌試管：16mm×160mm、15mm×100mm。滅菌吸管：1mL(0.01mL刻度)、10mL(0.1mL刻度)。滅菌錐形瓶：200mL、500mL。90mm。全自動細菌生化鑒定儀，如VITEK。培育基和試劑改進磷酸鹽緩沖液：見第A.1章。CIN-1培育基：見第A.2章。改進Y培育基：見第A.3章。改進克氏雙糖培育基：見第A.4章。糖發(fā)酵管：見第A.5章。鳥氨酸脫羧酶試驗培育基：見第A.6章。半固體瓊脂：見第A.7章。緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)V—P試驗用]：見第A.8章。堿處理液：見第A.9章。尿素培育基：見第A.10章。API20E生化鑒定試劑盒或VITEKGNI+生化鑒定卡。檢驗程序小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗程序見圖1。圖1 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏茵檢驗程序操作步驟增菌以無菌操作稱取25g(或25mL)樣品放入含有225mL改進磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯或均8000r／minlmin1min。液體樣品或粉末狀樣品，應26℃±l48h～72h。堿處理除乳及其制品外，其他食品的增菌液0.5mL4.5mL充分混合l5s。分別CIN-1瓊脂平板和改進Y26℃±l48h±2hCIN-1Y瓊脂平板上為無色透亮、不粘稠的菌落。改進克氏雙糖試驗3個～5個，接種改進克氏雙糖斜面，于26℃±l24h，將斜面和底部皆變黃不產(chǎn)氣者做進一步的生化鑒定。尿素酶試驗和動力觀看將改進克氏雙糖上的可疑培育物接種到尿素培育基上，留意接種量要大，挑取一接種環(huán)，26l2h～4h，然后將陽性者接種兩管半固體，分別于26℃±l℃和36℃±l24h26℃有動力的可疑菌落接種養(yǎng)分瓊脂平板，進展革蘭氏染色和生化試驗。革蘭氏染色鏡檢小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌呈革蘭氏陰性球桿菌，有時呈橢圓或桿狀，大小為(0.8μm～3.0μm)×0.8μm。生化鑒定常規(guī)生化鑒定：從養(yǎng)分瓊脂平板上挑取單個菌落做生化試驗，全部的生化反響皆在工程小腸結(jié)腸炎中間型耶爾弗氏耶爾森克氏耶爾森假結(jié)核耶爾鼠疫耶爾森注：+陽性；-陰性；d有不同生化型。26℃工程小腸結(jié)腸炎中間型耶爾弗氏耶爾森克氏耶爾森假結(jié)核耶爾鼠疫耶爾森注：+陽性；-陰性；d有不同生化型。耶爾森氏菌森氏菌氏菌氏菌森氏菌氏菌動力(26℃)+++++-尿素酶+++++-VP試驗(26℃)+++---鳥氨酸脫羧酶++++--蔗糖d++---棉子糖-+---d山梨醇++++--甘露醇++++++鼠李糖-++--+生化鑒定系統(tǒng)可選擇使用兩種生化鑒定系統(tǒng)(APl20E或VITEKGNI+)API20E：從養(yǎng)分瓊脂平板上挑取單個菌落，依據(jù)API20E操作手冊進展并判讀結(jié)果。VITEK全自動細菌生化：從養(yǎng)分瓊脂平板上挑取單個菌落，依據(jù)VITEKGNI+操作手冊進展并判定結(jié)果。血清型鑒定除進展生化鑒定外，可選擇做血清型鑒定。具體操作方法按GB／T4789.40因子血清分型。結(jié)果報告25g(25mL)樣品中檢出或未檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。附錄A(標準性附錄)培育基和試劑改進磷酸鹽緩沖液成分磷酸氫二鈉8.23g磷酸二氫鈉1.2g氯化鈉 5.0g三號膽鹽 1.5g山梨醇 20g制法將磷酸鹽及氯化鈉溶于蒸餾水中，再參與三號膽鹽及山梨醇，溶解后校正pH為7.6，分12115min，備用。CIN-1培育基根底培育基：胰胨20.0g酵母浸膏2.0g甘露醇20.0g氯化鈉1.0g去氧膽酸鈉2.0g硫酸鎂0.01g瓊脂l2.0g蒸餾水950mLpH7.5±0.112115min，備用。Irgasan：以95％的乙醇作溶劑，溶解二苯醚，配成0.4％的溶液，待根底培育基冷至801mL混勻。50℃時，參與：中性紅(3mg／mL) 10.0mL結(jié)晶紫(0.1mg／mL) 10.0mL頭孢菌素(1.5mg／mL) 10.0mL生霉素(0.25mg／mL)10.0mL最終不斷攪拌參與l0.0mL10％氯化鍶，傾注平皿。改進Y培育基成分蛋白胨 15.0g氯化鈉 5.0g乳糖 l0.0g草酸鈉 2.0g去氧膽酸鈉6.0g三號膽鹽5.0g丙酮酸鈉2.0g孟加拉紅40mg水解酪蛋白5.0g瓊脂17g蒸餾水1000ml.制法將上述成分混合，校正pH7.4±0.1。于121℃高壓滅菌15min，待冷至45℃左右時，傾注平皿。改進克氏雙糖培育基成分蛋白胨 20g牛肉膏 3g酵母膏 3g山梨醇 20g葡萄糖 1g氯化鈉 5g檸檬酸鐵銨0.5g硫代硫酸鈉0.5g瓊脂 12g酚紅 0.025g蒸餾水 1000mlpH7.4制法將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH。參與0.o2％的酚ETJ(溶液l2.5mLl21℃高壓滅菌15rain，放置高層斜面?zhèn)溆?。糖發(fā)酵管成分牛肉膏 5g蛋白胨 10g氯化鈉 3g磷酸氫二鈉 2g0.2％溴麝香草酚藍溶液 12mL蒸餾水 1000mLpH7.4制法葡萄糖發(fā)酵管按上述成安排好后，按0.5％參與葡萄糖，分裝于有一個倒置小管的小試管內(nèi)，12115min。l00mL，12115min。另10％溶液，同時高壓滅菌。將5mL100mL培育基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。注：蔗糖不純，加熱后會自行水解者，應承受過濾法除菌。試驗方法從瓊脂斜面上挑取少量培育物接種于26℃±l2d～3d14d～30d。鳥氨酸脫羧酶試驗培育基成分蛋白胨 5g酵母浸膏 3g葡萄糖 1g蒸餾水 1000mL1.6％溴甲酚紫-1mLL-鳥氨酸或DL-0.5g／100mL1g／100mLpH6.8制法l00mLL-鳥氨酸按0.5％參與，DL-1％加人。再校正pH6.8。比照培育基不加鳥氨酸。分裝于無菌的小試0.5mL，上面滴加一層液體石蠟，ll510min。試驗方法26℃±l18h～24h，觀看結(jié)果。鳥氨酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培育基呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培育基變?yōu)辄S色。比照管為黃色。半固體瓊脂成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化鈉0.5g瓊脂 0.35g～0.4g蒸餾水100mLpH7.4制法pH。分裝小試管，121℃高壓滅菌15min，直立凝固備用。注：供動力觀看、菌種保存、H抗原位相變異試驗等用。緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR和V—P試驗用)成分磷酸氫二鉀 5g多胨 7g葡萄糖 5g蒸餾水 1000mLpH7.0制法溶化后校正pH1mL，12115min。甲基紅(MR)試驗26℃±l2d～5d，哈夫尼亞菌則應在22℃～25℃培育。滴加甲基紅試劑一滴，馬上觀看結(jié)果。鮮紅色為陽性，黃色為陰性。甲基紅試劑配法：l0mg30mL9520mL蒸餾水。V-P試驗26℃±l2d～4d22℃～25℃培育。參與％萘酚乙醇溶液0.5mL和40％氫氧化鉀溶液0.2m，充分振搖試管，觀看結(jié)36℃土l4h再進展觀看。堿處理液0.5％氯化鈉溶液氯化鈉 0.5g蒸餾水 100mL0.5％氫氧化鉀溶液氫氧化鉀0.5g蒸餾水 100mL制法0.50.5％氫氧