獸醫(yī)生物制品基本生產(chǎn)技術-菌（毒）種選育技術（獸醫(yī)生物制品技術）

菌（毒）種的標準1.來源清楚，資料完整原始細菌或病毒的來源地區(qū)、動物品種和流行資料應清楚；分離鑒定資料完整；傳代、保藏和生物學特性檢查方法明確。任何來歷不明或傳代歷史不清的菌（毒）種，不能用于生物制品生產(chǎn)。2.生物學特性典型生物學特性包括菌（毒）種的形態(tài)特征，培養(yǎng)特性、生化特性、毒力特性、免疫學特性等，是鑒定菌（毒）種的重要標志，用以與其它微生物相區(qū)分。如果發(fā)現(xiàn)某些性狀發(fā)生改變，就意味著菌（毒）種發(fā)生了變異或有外源污染，應及時廢棄或更換。如果是制造弱毒疫苗，應特別注意與強毒株生物性狀區(qū)別的要點，以保證制品的安全性和免疫原性。菌（毒）種的標準菌（毒）種的標準3．遺傳性狀穩(wěn)定純一菌(毒)種是一個相對群體，在長期保存、傳代和使用過程中，受各種因素影響可能發(fā)生遺傳性狀的變異。若變異的幅度過大，就會影響制品的質(zhì)量甚至安全性。因此要求菌（毒）種的遺傳性狀要穩(wěn)定，不易發(fā)生變異，即使發(fā)生變異，也要嚴格限制在一定的范圍內(nèi)。提高或保持菌(毒)種純一性和穩(wěn)定性的方法是經(jīng)常對其進行挑選、純化或克隆化。菌（毒）種的標準4.毒力在規(guī)定范圍內(nèi)各種獸醫(yī)生物制品，所用菌(毒)種的毒力都要在規(guī)定的范圍內(nèi)。用于制造弱毒疫苗的菌（毒）種，在保持良好免疫原性的前提下，毒力應盡可能弱些。用于制造滅活疫苗、免疫血清及進行疫苗效力檢測的菌（毒）種，應為強毒菌（毒）種，而且抗原性要盡量高。菌（毒）種的概念與分類1.概念獸醫(yī)生物制品菌(毒)種主要指應用于獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)、檢定和研究的細菌菌種、病毒毒種，也包括生物分類地位在原蟲以下的生物種。菌（毒）種的概念與分類2.分類（1）按毒力強毒菌（毒）種具有強大致病力并且免疫原性良好的菌（毒）種，常用于制造某些滅活疫苗、免疫血清及進行疫苗效力檢驗。弱毒菌（毒）種對動物無致病力或致病力微弱并且具有一定免疫原性的菌（毒）種，主要用于制造弱毒疫苗。菌（毒）種的概念與分類（2）按用途生產(chǎn)用菌（毒）種①直接生產(chǎn)用菌（毒）種直接由本微生物或其產(chǎn)物制備獸醫(yī)生物制品（疫苗、類毒素等）。②免疫用菌（毒）種主要用于生產(chǎn)免疫血清和診斷血清。菌（毒）種的概念與分類③加工用菌（毒）種應用于獸醫(yī)生物制品的加工過程。如，制備沙門氏菌單因子血清時，用某種沙門氏菌免疫家兔獲得免疫血清為群因子血清，再用與上述菌有類屬抗原的沙門氏菌吸收掉血清中的類屬抗體便獲得單因子血清，后者（吸收菌)就是參與加工的菌種。菌（毒）種的概念與分類工具菌（毒）種在獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中只作為工具使用。如，構建亞單位疫苗、核酸疫苗所用的受體菌。檢定用菌（毒）種用于獸醫(yī)生物制品某些項目檢驗。如，疫苗效力檢驗攻毒用的強毒菌（毒）種，用于血清效價及特異性測定用的菌（毒）種等。標準菌（毒）株或參考菌（毒）株在研究或其他特殊問題鑒定等方面必要的參考菌（毒）種。菌（毒）種的鑒定

鑒定項目1.毒力鑒定2.抗原性鑒定3.穩(wěn)定性鑒定菌（毒）種的鑒定1.毒力鑒定常用易感實驗動物、禽胚或細胞測定菌（毒）種的半數(shù)致死量（LD50)、半數(shù)感染量(ID50)、禽胚半數(shù)致死量(ELD50)、禽胚半數(shù)感染量(EID50)、組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)等。菌（毒）種的鑒定設陽性和陰性對照

陰性對照：不接種或只接種無菌生理鹽水，目的是要闡明所用的實驗動物、雞胚或細胞是否健康，管理是否適當。

陽性對照：是接種已知致病力的同種微生物，目的是要闡明被接種的動物、雞胚或細胞對接種物的敏感性，以免因?qū)嶒灄l件不完善而得到錯誤的結論。

如果陰性對照發(fā)病或死亡，實驗不能成立；如果陽性對照不病不死，說明所用的實驗動物、雞胚或細胞不適宜，或存在其它干擾因素。菌（毒）種的鑒定具體鑒定方法將培養(yǎng)物連續(xù)遞進稀釋，將不同稀釋度的培養(yǎng)物定量接種一定數(shù)量的動物（雞胚或細胞），統(tǒng)計被接種對象在規(guī)定時間內(nèi)的發(fā)病或死亡數(shù)（細胞病變數(shù)），按Reed-Muench法計算結果。數(shù)字越小說明致病力越強。菌（毒）種的鑒定LD50測定實例將某病毒培養(yǎng)物進行10倍遞進稀釋后，取幾個連續(xù)的稀釋度各接種小鼠5只，每只接種量0.1ml，在規(guī)定日期內(nèi)死亡、生存及其累積數(shù)見下表：稀釋度結果累積數(shù)死亡率%生存死亡生存死亡總數(shù)10-7050111110010-8141678610-9324263310-10509090菌（毒）種的鑒定Reed-Muench法計算公式

比距（L）=（高于50%的死亡率-50%）/（高于50%的死亡率-低于50%的死亡率）lgLD50=死亡率高于50%的稀釋度的對數(shù)—L×稀釋倍數(shù)的對數(shù)。將數(shù)值代入公式L=（86-50）/（86-33）=0.68lgLD50=lg10-8－0.68×1=-8.68LD50=10-8.68，表示該病毒稀釋至10-8.68時，每只小鼠接種0.1ml，能使50%的小鼠死亡。菌（毒）種的鑒定2.抗原性鑒定抗原性包括免疫原性和反應原性。免疫原性測定：通常是將菌（毒）株按各自的方法制成疫苗，免疫動物，同時設立陰性對照和陽性對照，經(jīng)1～3周，所有動物均用致死量的強毒攻擊，以保護率表示。在陰性對照、陽性對照結果正確的情況下，抗致死量強毒越多，保護率越高者，免疫原性越好。反應原性測定：一般采用血清學方法，以抗體滴度或效價表示。菌（毒）種的鑒定3.穩(wěn)定性鑒定一般采用培養(yǎng)基、動物、禽胚或細胞對菌（毒）株進行傳代培養(yǎng)，觀察其生物學特性，測定其毒力和抗原性，以證明其遺傳性狀的穩(wěn)定。強毒菌（毒）種選育1.強毒菌(毒)株的來源疾病流行地區(qū)，在疾病流行初中期，從臨床癥狀和病理變化典型而又未經(jīng)任何治療的病例。強毒菌（毒）種選育2.強毒菌（毒）種的選育程序病料采集→病原分離→純粹檢驗（證明不含其他微生物）→鑒定（毒力、抗原性、穩(wěn)定性）→篩選出毒力強、抗原性好、性狀穩(wěn)定的菌（毒）株→增殖→凍干保存弱毒菌（毒）種選育1.獲取自然弱毒株自然弱毒株又稱自發(fā)突變毒株，由自然強毒株在自然因素作用下因基因突變形成的生物株，獲取機率低。

（1）同源弱毒株

如，雞新城疫LaSota弱毒株和D10弱毒株分離于自然雞群和鴨群

（2）異源弱毒株

如，火雞皰疹病毒FC126株分離于火雞弱毒菌（毒）種選育2.人工致弱強毒株人工致弱強毒株指人為地采取一些措施，使強毒菌（毒）株的毒力減弱，而盡可能保留抗原性，從而培育出弱毒菌（毒）種，是培育弱毒種的主要方法。人工致弱的途徑（1）物理途徑

高溫、干燥和紫外線等不適宜的物理條件（2）化學途徑化學誘變劑弱毒菌（毒）種選育（3）生物途徑適應非易感動物通常用兔、小鼠、豚鼠和雞等實驗動物進行，多采取大劑量腹腔、靜脈或腦內(nèi)接種。適應細胞常采用同源或異源動物組織的原代細胞進行。雜交減毒將兩種遺傳性狀不同的菌(毒)株，進行自然雜交，導致不同菌(毒)株間發(fā)生基因交換而育成有使用價值的弱毒株。弱毒菌（毒）種選育（4）基因工程途徑利用重組DNA技術，將強毒株的致病基因切除獲得弱毒或無毒株，但保留免疫原性和感染