瀘州山銀花及其提取物高效液相色譜指紋圖譜研究

瀘州山銀花及其提取物高效液相色譜指紋圖譜研究【摘要】目的建立瀘州山銀花及其提取物的指紋譜檢測標準。方法以綠原酸為參照物，采用LichrosorbC18色譜柱，以甲醇-％磷酸溶液為流動相，流速為ml·min-1，檢測波長為326nm。結(jié)果藥材、提取物分別有6個和9個共有峰，共有峰的技術(shù)參數(shù)和相似度符合國家藥品監(jiān)督局頒布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》和國家藥典委員會頒布的《中藥注射劑指紋圖譜實驗研究技術(shù)指南》的有關(guān)規(guī)定。結(jié)論該方法準確，重復(fù)性好，建立的指紋圖譜檢測標準，可作為山銀花及其提取物質(zhì)量評價與品種鑒別的重要依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】山銀花；提取物；高效液相色譜；指紋圖譜

Abstract:ObjectiveToestablishthefingerprintdetectingstandardofFlosLoniceraeanditsextract.MethodsChlorogenicacidwasusedasthereferencesubstance.TheseparationwascarriedoutonaLichrosorbC18columnwith％phosphoricacidsolution(38∶62)asmobilephase．Theflowratewasml·min-1，thedetectionwavelengthwassetat326nm.ResultsThemedicinalmaterialsandextractrespectivelyhad6and9commonpeaks，theparameterofwhichmetwiththestipulationofChineseMedicineInjectionFingerprintTechnicalRequirementsandChineseMedicineInjectionFingerprintExperimentalTechnicalGuides．ConclusionThemethodissimpleandaccuratewithagoodreproducibilityandcanbeusedforqualityevaluationandvarietydiscriminationofFlosLoniceraeanditsextract.

Keywords:FlosLonicerae；Extract；HPLC；Fingerprint

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.，紅腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.或華南忍冬LoniceraconfuseDC.的干燥花蕾或帶初開的花，具有抗菌消炎、清熱解毒、涼散風熱的功效，主要用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫熱發(fā)病等疾?。?］。山銀花主要有效成分為綠原酸和異綠原酸。不同來源的山銀花，由于受到產(chǎn)地、氣候、采收時間及加工方法的影響，致使其有效成分的含量存在著一定的差異，從而影響其療效。四川瀘州山銀花作為川銀花的一個重要來源，其指紋圖譜測定尚未見報道。為全面評估本地區(qū)山銀花及其提取物有效成分的變化及差異，實驗采用HPLC法首次建立了瀘州四縣不同產(chǎn)區(qū)采集的山銀花及其提取物的指紋圖譜，為其質(zhì)量控制、藥材鑒別以及進一步開發(fā)利用本地區(qū)的山銀花提供科學依據(jù)。

1儀器與試藥

儀器戴安高效液相色譜儀；瑞士Precisa電子天平；CQX25-06超聲波清洗器。

對照品綠原酸，中國藥品生物制品檢定所提供。

試藥甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

樣品山銀花，10批。分別收購于瀘州納溪、敘永、合江和古藺。經(jīng)作者鑒定均為灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.的干燥花蕾。山銀花提取物，自制。

表1山銀花樣品來源

樣品批號產(chǎn)地采收時間050701瀘州市納溪縣2005-07-01050702瀘州市納溪縣2005-07-02050801瀘州市敘永縣2005-08-01050802瀘州市敘永縣2005-08-02050803瀘州市合江縣2005-08-03050804瀘州市合江縣2005-08-04050805瀘州市古藺縣2005-08-05050806瀘州市古藺縣2005-08-06050807瀘州市古藺縣2005-08-07050808瀘州市古藺縣2005-08-08

2方法與結(jié)果

色譜條件色譜柱為LichrosorbC18，流動相為乙腈-％磷酸溶液，流速ml·min-1，柱溫35℃，檢測波長326nm。

參照物溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的綠原酸對照品mg，精密稱定，置50ml棕色量瓶中，加50％甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備

山銀花供試品溶液取山銀花適量，50℃烘約5h，粉碎為細粉。取約g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，稱定重量，超聲處理45min，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密取續(xù)濾液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

山銀花提取物供試品溶液精密稱取本品10mg，加50％甲醇溶液40ml，超聲處理2min，濾過，用少許50％甲醇溶液洗滌，置50ml量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

方考察

穩(wěn)定性實驗取山銀花藥材供試品溶液，分別于制備后0，4，8，16，24，36h檢測指紋譜。以綠原酸峰的保留時間和峰面積為參照，各共有峰的相對保留時間、峰面積比值基本一致，其RSD均小于3％。表明供試品溶液在36h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜的技術(shù)要求［2］。

精密度實驗取山銀花藥材供試品溶液，連續(xù)進樣5次，檢測指紋圖譜。各共有峰的相對保留時間、單峰面積占總峰面積≥10％的色譜峰峰面積比值基本一致，其RSD均小于3％。表明精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

重復(fù)性實驗取山銀花藥材樣品5份，按“”項下方法制備供試品溶液，分別檢測指紋圖譜。以綠原酸峰的保留時間和峰面積為參照，各共有峰的相對保留時間、單峰面積占總峰面積≥10％的色譜峰峰面積比值基本一致，其RSD均小于3％，表明重復(fù)性較好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

山銀花藥材HPLC指紋圖譜的建立

指紋圖譜的建立及共有指紋峰的標定精密吸取綠原酸參照溶液和山銀花供試品溶液10μl，分別注入液相色譜儀，記錄25min的色譜圖，即得。比較不同產(chǎn)地樣品的色譜圖，其中6個色譜峰是共有的，確定為共有指紋峰見圖1。不同批次藥材指紋圖譜比較見圖2。

圖1山銀花藥材標準指紋圖譜

圖210批山銀花藥材的指紋圖譜

共有指紋峰技術(shù)參數(shù)的確定比較10個批次山銀花樣品的色譜圖，以綠原酸色譜峰作為參照峰，計算各共有指紋峰的保留時間、相對保留時間、峰面積比值和峰面積比值差值。結(jié)果見表2。表2山銀花藥材HPLC指紋圖譜技術(shù)參數(shù)

山銀花藥材指紋圖譜的相似度評價結(jié)果運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對10批山銀花藥材的指紋圖譜進行相似度分析，以批號為050701的藥材的指紋圖譜作為參照圖譜，以平均數(shù)法生成10批藥材的對照指紋圖譜，10批山銀花與對照指紋圖譜相似度分別為：，，，，，，，，，。符合國家藥典委員會頒布的《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術(shù)指南》中的相關(guān)規(guī)定。

山銀花提取物HPLC指紋圖譜的建立

指紋圖譜的建立及共有指紋峰的標定精密吸取綠原酸參照溶液和山銀花提取物供試品溶液10μl，分別注入液相色譜儀，記錄25min的色譜圖，即得。比較不同產(chǎn)地山銀花提取物的色譜圖，其中9個色譜峰是共有的，確定為共有指紋峰見圖3。不同批次山銀花提取物指紋圖譜比較見圖4。

圖3山銀花提取物標準指紋圖譜

共有指紋峰技術(shù)參數(shù)的確定比較10個批次山銀花樣品的色譜圖，以綠原酸色譜峰作為參照峰，計算各指紋共有峰的保留時間、相對保留時間、峰面積比值和峰面積比值差值。結(jié)果見表3。表3山銀花提取物HPLC指紋圖譜技術(shù)參數(shù)

山銀花提取物指紋圖譜的相似度評價結(jié)果運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對10批山銀花提取物的指紋圖譜進行相似度分析，以批號為060905的提取物的指紋圖譜作為參照譜圖，以平均數(shù)法生成10批提取物的對照指紋圖譜，十批山銀花提取物與對照指紋圖譜相似度分別為：，，，，，，，，，。符合國家藥典委員會頒布的《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術(shù)指南》中相關(guān)規(guī)定［3］。

3討論

在相同的色譜條件下，山銀花藥材與山銀花提取物分別有6個和8個共有峰。從圖1、圖3可見，山銀花提取物除3、4、7號峰外，其余l(xiāng)，S，2，5，6，8號峰分別與藥材1，S，2，3，4，5號峰相對應(yīng)，表明提取物與藥材指紋圖譜之間具有較好的相關(guān)性。但提取物各共有指紋峰與藥材對應(yīng)指紋峰比較，百分峰面積差異較大，這是提取純化過程受酸堿影響，綠原酸、異綠原酸異構(gòu)體互為轉(zhuǎn)化而發(fā)生量變所致。

通過實驗研究，10批山銀花藥材及其提取物HPLC指紋圖譜相似度較高，