纖維素酶的生產(chǎn)方法及在食品行業(yè)的應(yīng)用

纖維素酶的生產(chǎn)方法及在食品行業(yè)的應(yīng)用纖維素酶(cellulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單成分酶，而是由多個(gè)酶起協(xié)同作用的多酶體系。纖維素酶在擴(kuò)大食品工業(yè)原料和植物原料的綜合利用，提高原料利用率，凈化環(huán)境和開辟新能源等方面具有十分重要的意義。編號(hào)：EC3.2.1.4。由多種水解酶組成的一個(gè)復(fù)雜酶系，自然界中很多真菌都能分泌纖維素酶。習(xí)慣上，將纖維素酶分成三類：C1酶、Cx酶和p葡糖苷酶。C1酶是對纖維素最初起作用的酶，破壞纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。Cx酶是作用于經(jīng)C1酶活化的纖維素、分解P-1，4-糖苷鍵的纖維素酶。。葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖。纖維素酶是一種重要的酶產(chǎn)品，是一種復(fù)合酶，主要由外切P-葡聚糖酶、內(nèi)切P-葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶等組成，還有很高活力的木聚糖酶活力。由于纖維素酶在飼料、酒精、紡織和食品等領(lǐng)域具有巨大的市場潛力，已被國內(nèi)外業(yè)內(nèi)人士看好，將是繼糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工業(yè)酶種，甚至在中國完全有可能成為第一大酶種，因此纖維素酶是酶制劑工業(yè)中的一個(gè)新的增長點(diǎn)纖維素酶的來源纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、微生物、細(xì)菌、放線菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。目前，用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種較多的是絲真菌，其中酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(As?pergillus)和青霉屬(Penicillium)，特別是綠色木霉(Trichodermavirde)及其近緣菌株等較為典型，是目前公認(rèn)的較好的纖維素酶生產(chǎn)菌?，F(xiàn)已制成制劑的有綠色木霉、黑曲霉、鐮刀霉等纖維素酶。同時(shí)，反芻動(dòng)物依靠瘤胃微生物可消化纖維素，因此可以利用瘤胃液獲得纖維酶的粗酶制劑。另外，也可利用組織培養(yǎng)法獲得所需要的微生物。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來自于真菌，比較典型的有木酶屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)。產(chǎn)生纖維素酶的菌種容易退化，導(dǎo)致產(chǎn)酶能力降低。纖維素酶在食品行業(yè)和環(huán)境行業(yè)均有廣泛應(yīng)用。在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，纖維素酶的添加可以增加原料的利用率，并對酒質(zhì)有所提升。由于纖維素酶難以提純，實(shí)際應(yīng)用時(shí)一般還含有半纖維素酶和其他相關(guān)的酶，如淀粉酶(amylase)、蛋白酶(Protease)等。纖維素酶種類繁多，來源很廣。不同來源的纖維素酶其結(jié)構(gòu)和功能相差很大。由于真菌纖維素酶產(chǎn)量高、活性大，故在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中應(yīng)用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。纖維素酶的生產(chǎn)方法目前，纖維素酶的生產(chǎn)主要有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方法。1固體發(fā)酵法是以玉米等農(nóng)作物秸稈為主要原料，其投資少，工藝簡單，產(chǎn)品價(jià)格低廉，目前國內(nèi)絕大部分纖維素生產(chǎn)廠家均采用該技術(shù)生產(chǎn)纖維素酶。然而固體發(fā)酵法存在根本上的缺陷，以秸稈為原料的固體發(fā)酵法生產(chǎn)的纖維素酶很難提取、精制。目前，我國纖維素酶生產(chǎn)廠家只能采用直接干燥法粉碎得到固體酶制劑或用水浸泡后壓濾得到液體酶制劑，其產(chǎn)品外觀粗糙且質(zhì)量不穩(wěn)定，發(fā)酵水平不穩(wěn)定，生產(chǎn)效率較低，易污染雜菌，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。2液體發(fā)酵法是將玉米秸稈粉碎至20目以下進(jìn)行滅菌處理，然后送發(fā)酵釜內(nèi)發(fā)酵，同時(shí)加入纖維素酶菌種，發(fā)酵時(shí)間約為70h，溫度低于60°C。采用除菌后的無菌空氣從釜低通入進(jìn)行通氣攪拌，發(fā)酵完畢后的物料經(jīng)壓濾機(jī)板框過濾、超濾濃縮和噴霧干燥后制得纖維素酶產(chǎn)品。液態(tài)深層發(fā)酵由于具有培養(yǎng)條件容易控制，不易染雜菌，生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為國內(nèi)外重要的研究和開發(fā)方向。纖維素酶菌種選育菌種選育是纖維素酶生產(chǎn)的基礎(chǔ)性工作，國內(nèi)外許多專家進(jìn)行了大量研究，為了生產(chǎn)高質(zhì)量的纖維素酶產(chǎn)品， 生家林等（1996）在吸收國內(nèi)外經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，先后引進(jìn)了綠色木霉木10、綠色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉XX-15A，在此基礎(chǔ)上，采用了紫外線、特定電磁波輻射、線性加速器，亞硝基胍等物理、化學(xué)的誘變方法，獲得了高產(chǎn)菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固體培養(yǎng)活力經(jīng)輕工部食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心南京站檢測表明， 濾紙活力為3670u/g,C1-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已達(dá)到國際先進(jìn)水平。此菌種在工廠化生產(chǎn)中性能穩(wěn)定。張苓花等（1998）采用康氏木霉W-925，J-931，經(jīng)過濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線（15W、30cm、2min）復(fù)合誘變后，得到了產(chǎn)酶活性高的Wu-932菌種，該菌種CMC糖化力達(dá)到2975，濾紙?zhí)敲富钚詾?31，比出發(fā)菌W-925分別提高了100%和81%?；げ匡暳咸砑觿┘夹g(shù)服務(wù)中心王成書等（1997）采用該中心的里氏木霉A3先進(jìn)行紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變后，將處理過的抱子接種于纖維雙層平板上，30C培養(yǎng)5-8天，15C放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進(jìn)行三角瓶瞄發(fā)酵再篩選，得到了產(chǎn)纖維素酶活力很高的里氏木霉 91-3菌株。纖維素酶菌種易退化，退化后其產(chǎn)酶力明顯降低，其原因可能有三個(gè)方面：①經(jīng)誘變篩選的菌種發(fā)生回復(fù)突變。②自然負(fù)突變。③菌種長時(shí)間低溫斜面保藏，會(huì)在分生抱子上長出次生菌絲，而次生菌絲所形成的分生抱子生命力弱，這可能是菌種退化的主要原因。為了避免纖維素酶菌種退化，張苓花等（1998）報(bào)道，采用砂土管保藏菌種。即將過篩洗凈的砂子與土以3:2比例混合分裝在試管內(nèi)，用1kg/cm2壓力滅菌30分鐘共三次，將欲保存的斜面菌種制備成 1000ml抱子懸浮液，每個(gè)砂土管注入0.5ml，搖勻，放入盛有無水CaCl2真空干燥器內(nèi)保存。經(jīng)測定，在所測的121天內(nèi)，酶的活性基本不變；酶活性下降50%的時(shí)間，由常規(guī)方法的60天延長至160天，明顯地減緩了菌種退化速度。發(fā)酵工藝?yán)w維素酶的生產(chǎn)工藝主要有兩種，即固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，其工藝如下：1、影響產(chǎn)酶量和活力的因素：影響纖維素酶產(chǎn)量和活力的因素很多，除菌種外，還有培養(yǎng)溫度、pH、水分、基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。 張中良等（1997）采用均勻設(shè)計(jì)Cl12（1210），以綠色木霉（T.ViriclePers.expr）為菌種，研究了影響產(chǎn)纖維素酶的五大因素對產(chǎn)酶量和活力的作用，認(rèn)為基質(zhì)粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31C條件下培養(yǎng)45h可獲得最大產(chǎn)酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g.h。王成華等（1997）也研究了其誘變篩選的里氏木霉91-3的產(chǎn)酶條件，結(jié)果表明該菌種以7：3的秸稈粉和麥麩，另添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養(yǎng)基，28-32°C為適宜培養(yǎng)溫度，30°C為最佳溫度，4%為最佳接種量，96h到達(dá)發(fā)酵高峰。張苓花等（1998）研究了以康氏木霉W-925為出發(fā)菌，經(jīng)誘變后得到的Wu-932纖維素酶高產(chǎn)菌的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，以1：2的麥麩和稻草粉為培養(yǎng)基，5%的接種量，稻草粉碎平均長度3-5mm，初始pH4-5，溫度在28-35C，發(fā)酵時(shí)間72h為最佳發(fā)酵條件。2、污染菌的控制：目前，在用康氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)飼用纖維素酶中，普遍存在一種俗稱的'白毛菌”污染。污染后輕者酶活性下降，重者發(fā)酵失敗。為此，研究控制發(fā)酵污染意義很大。張苓花等（1998）研究“白毛菌”的菌落特征、來源、生長和生理特征及控制方法，找到了一種與康氏木霉Wu-932呈共生關(guān)系，而與“白毛菌”呈競爭性抑制關(guān)系的熱帶假絲酵母菌J-931。利用此菌進(jìn)行混合發(fā)酵，可有效地控制“白毛菌”的污染。其微生態(tài)關(guān)系如下：纖維素酶的應(yīng)用1制酒在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)添加纖維素酶可顯著提高酒精和白酒的出酒率和原料的利用率，降低溶液的黏度，縮短發(fā)酵時(shí)間，而且酒的口感醇香，雜醇油含量低。纖維素酶提高出酒率的原因可能有兩方面：一是原料中部分纖維素分解成葡萄糖供酵母使用；另外，由于纖維素酶對植物細(xì)胞壁的分解，有利于淀粉的釋放和被利用。將纖維素酶應(yīng)用于啤酒工業(yè)的麥芽生產(chǎn)中可增加麥粒溶解性，加快發(fā)芽，減少糖化液中單一葡萄糖含量，改進(jìn)過濾性能，有利于酒精蒸餾。2醬油釀造在醬油的釀造過程中添加纖維素酶、可使大豆類原料的細(xì)胞膜膨脹軟化破壞，使包藏在細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和碳水化合物釋放，這樣既可提高醬油濃度，改善醬油質(zhì)量，又可縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)率，并且使其各項(xiàng)主要指標(biāo)提高3%。3飲料加工用纖維素酶處理豆腐渣后接入乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，可制得營養(yǎng)、品味俱佳的發(fā)酵飲料。將纖維素酶應(yīng)用于果蔬榨汁、花粉飲料中，可提高汁液的提取率（約10%）和促進(jìn)汁液澄清，使汁液透明，不沉淀，提高可溶性固形物的含量，并可將果皮綜合利用。目前，有報(bào)道已成功地將柑橘皮渣酶解制取全果飲料，其中的粗纖維有50%降解為短鏈低聚糖，即全果飲料中的膳食纖維，具有一定的保健醫(yī)療價(jià)值。4纖維廢渣的回收利用應(yīng)用纖維素酶或微生物把農(nóng)副產(chǎn)品和城市廢料中的纖維轉(zhuǎn)化成葡萄糖、酒精和單細(xì)胞蛋白質(zhì)等，這對于開辟食品工業(yè)原料來源，提供新能源和變廢為寶具有十分重要的意義。此外，在果品和蔬菜加工過程中如果采用纖維素酶適當(dāng)處理，可使植物組織軟化膨松，能提高可消化性和口感。將纖維素酶用于處理大豆，可促使其脫皮，同時(shí)，由于它能使細(xì)胞壁破壞，使包含其中的蛋白質(zhì)、油脂完全分離，增加其從大豆和豆餅中提取優(yōu)質(zhì)水溶性蛋白質(zhì)和油脂的獲得率，既降低了成本，縮短了時(shí)間，又提高了產(chǎn)品質(zhì)量。植物纖維原料是地球上最豐富、最廉價(jià)而又可再生的資源，其主要成分是纖維素和半纖維素，纖維素和半纖維素的利用一直是國際國內(nèi)的研究熱點(diǎn)課題。利用的途徑和整體思路是利用纖維素酶和半纖維素酶先將纖維素和半纖維素降解成可發(fā)酵糖，進(jìn)而通過發(fā)酵制取酒精、單細(xì)胞蛋白、有機(jī)酸、甘油、丙酮及其他重要的化學(xué)化工原料。此外，纖維素、半纖維素通過纖維素酶的限制性降解還可制備成功能性食品添加劑，如微晶纖維素、膳食纖維和功能性低聚糖等。總之，纖維素酶具有非常廣闊的應(yīng)用前景，但由于液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)含量較高，在大規(guī)模生產(chǎn)上還有一定的困難，因此對纖維素酶液態(tài)發(fā)酵的研究與開發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。今后若能加強(qiáng)這方面的研究，則可以使之早日進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，一方面可以提高纖維素酶的產(chǎn)量和質(zhì)量；另一方面可以較好地解決纖維素的生物轉(zhuǎn)化問題，創(chuàng)造良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效X益.0展望我國是一個(gè)飼料資源十分緊張的國家，土地少、人口多，人畜爭糧的矛盾十分突出。要保持我國飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，必須解決好飼料問題，否則將嚴(yán)重制約其發(fā)展。纖維素是自然界中十分豐富的資源，是800-1200個(gè)葡萄糖分子聚合而成。因此，可通過微生物發(fā)酵充分利用農(nóng)副產(chǎn)品下腳料、秸稈、糠生產(chǎn)纖維素酶添加劑，用于提高畜禽生產(chǎn)性能，提高飼料利用率，改善飼料的營養(yǎng)價(jià)值，降低飼料成本和提高經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的開發(fā)前景，今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)纖維素酶研究和開發(fā)工作。主要有如下幾方面：1、 進(jìn)一步加強(qiáng)纖維素酶的作用機(jī)制研究。纖維素酶應(yīng)用于飼料，作用于動(dòng)物消化道，其機(jī)制尚未清楚。從理論上決定其添加量還很困難，目前只能從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來決定，受影響因素很多，往往效果不夠理想。對于單