血清清、球蛋白分離(新)

1內(nèi)容實驗目的1實驗原理2實驗材料3實驗過程45注意事項當前第1頁\共有26頁\編于星期四\11點2實驗目的掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法了解柱層析技術(shù)當前第2頁\共有26頁\編于星期四\11點實驗分組四個人一小組當前第3頁\共有26頁\編于星期四\11點4實驗過程鹽析（粗分離）葡聚糖凝膠層析（脫鹽）DEAE纖維素離子交換層析（純化）醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）當前第4頁\共有26頁\編于星期四\11點5實驗材料人混合血清葡聚糖凝膠（G-25)層析柱DEAE纖維離子交換層析柱飽和硫酸銨溶液醋酸銨緩沖溶液20%磺基水楊酸1%BaCl2溶液氨基黑染色液漂洗液pH8.6巴比妥緩沖溶液電泳儀、電泳槽當前第5頁\共有26頁\編于星期四\11點6實驗原理蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學及其生物學功能的重要手段。不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。當前第6頁\共有26頁\編于星期四\11點7

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與常用的分離純化方法蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)常用的純化方法分子質(zhì)量透析、超濾凝膠層析★離心溶解度調(diào)整pH調(diào)整離子強度★降低介電常數(shù)電荷電泳★等電聚焦離子交換層析★特異結(jié)合部位親和層析其他性質(zhì)吸附層析液相層析氣相層析當前第7頁\共有26頁\編于星期四\11點8球蛋白12等電點4.885.065.065.126.85~7.3相對分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點、平均分子量及正常含量清蛋白A當前第8頁\共有26頁\編于星期四\11點91.粗提（鹽析法）由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達到分離的目的。血清清蛋白球蛋白半飽和硫酸銨清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸餾水溶解當前第9頁\共有26頁\編于星期四\11點鹽析法鹽析法是在蛋白質(zhì)溶液中，加入無機鹽至一定濃度或達飽和狀態(tài)，可使蛋白質(zhì)在水中溶解度降低，從而分離出來。水化膜減弱、消失。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。當前第10頁\共有26頁\編于星期四\11點112.脫鹽（凝膠層析）鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無機鹽，必須先脫鹽后才能進一步純化。脫鹽有多種方法，本實驗采用凝膠層析法。凝膠層析法主要是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大小的不同而將其分離的技術(shù)。當前第11頁\共有26頁\編于星期四\11點凝膠層析分離示意圖當前第12頁\共有26頁\編于星期四\11點13凝膠層析分離化合物示意圖當前第13頁\共有26頁\編于星期四\11點143.純化（離子交換層析）離子交換層析是指流動相中的離子和固定相上的離子進行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進行分離R-SO3-H++Pr+R-SO3-Pr++H+陽離子交換陰離子交換R-N+R3OH-+Pr-R-N+R3Pr-+OH-當前第14頁\共有26頁\編于星期四\11點15球蛋白12等電點4.885.065.065.126.85~7.3相對分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點、平均分子量及正常含量清蛋白A當前第15頁\共有26頁\編于星期四\11點0.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白pI4.9，帶負電荷多a、b球蛋白pI5.0～5.2，帶負電荷少a、b球蛋白被洗脫,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5

，帶負電荷g–球蛋白pI＞6.5，帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白被層析柱吸附,g-球蛋白被洗脫0.3mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷緩沖液離子強度增加清蛋白被洗脫當前第16頁\共有26頁\編于星期四\11點17當前第17頁\共有26頁\編于星期四\11點184.純度鑒定（電泳）血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果當前第18頁\共有26頁\編于星期四\11點19球蛋白12等電點4.885.065.065.126.85~7.3相對分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點、平均分子量及正常含量清蛋白A當前第19頁\共有26頁\編于星期四\11點20醋酸纖維素薄膜電泳原理血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。當前第20頁\共有26頁\編于星期四\11點21醋酸纖維素薄膜電泳1.點樣(粗面)8cm2cm點樣線點樣區(qū)1.5cm(粗面）點樣線盡量點得細窄而均勻,寧少勿多－＋小組標記樣品標記當前第21頁\共有26頁\編于星期四\11點222.電泳薄膜粗面向下點樣端置陰極端兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應輕輕拉平注意：切勿使點樣處與電泳槽接觸電壓：110V時間：50min。當前第22頁\共有26頁\編于星期四\11點233.染色和漂洗電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2次），至背景顏色脫凈為止。取出膜，用濾紙吸干即可。當前第23頁\共有26頁\編于星期四\11點用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液洗脫，流出液量約1ml時開始檢測蛋白質(zhì)取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時開始檢測蛋白質(zhì)凝膠柱層析除鹽磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時磺基水楊酸和BaCl2檢測可能同時陽性繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測SO42-陰性用2~3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時磺基水楊酸和BaCl2檢測可能同時陽性繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測SO42-陰性用2~3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡鹽析操作流程離子交換柱層析純化加樣加樣當前第24頁\共有26頁\編于星期四\11點用1ml0.0６mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約５mL0.06mol/LNH4AC緩沖液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白離子交換柱層純化除鹽后收集的清蛋白用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開始檢測蛋白質(zhì)取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10d，連續(xù)收集3管DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白除鹽后收集的球蛋白過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）用0.3mol/LNH4AC緩沖液(約3ml)洗脫，流出液量約2ml開始檢測蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10d，連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC緩沖液流洗再生平衡離子交換柱再生和蛋白純度鑒定2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)當前第25頁\共有26頁\編于星期四\11點26注意事項所用血清應新鮮，