分子生物學(xué)基本技術(shù)定稿

第一節(jié)分子雜交Section1MolecularHybridization當(dāng)前第1頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)一、核酸分子雜交

1.核酸分子雜交基本原理——核酸變性與復(fù)性◆核酸變性(denaturation)：由于外界因素影響，使核酸分子的空間結(jié)構(gòu)改變，并引起核酸理化性質(zhì)和生物學(xué)功能發(fā)生改變的現(xiàn)象。其本質(zhì)是維持核酸空間結(jié)構(gòu)的氫鍵和/或堿基堆積力受到破壞?！艉怂釓?fù)性(renaturation)：變性核酸在適當(dāng)條件下根據(jù)堿基配對(duì)原則重新恢復(fù)空間結(jié)構(gòu)的過程。復(fù)性可使核酸的理化性質(zhì)得到恢復(fù)。當(dāng)前第2頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)變性復(fù)性DNA的變性與復(fù)性當(dāng)前第3頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆核酸變性因素：加熱

pH

有機(jī)溶劑(如乙醇、尿素、甲酰胺、丙酰胺等)等◆核酸復(fù)性因素：核酸序列復(fù)雜程度：越簡(jiǎn)單復(fù)性越快核酸片段的大?。涸叫?fù)性越快核酸濃度：濃度越高復(fù)性越快離子強(qiáng)度：強(qiáng)度越高復(fù)性越快當(dāng)前第4頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)：核酸變性時(shí)，由于堿基外露使260nm處的紫外吸收值增加，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。反之，稱為減色效應(yīng)(hypochromiceffect)。不同來源DNA熱變性時(shí)的增色效應(yīng)7080901001.01.21.4A260nm溫度(℃)肺炎球菌(38%G+C)大腸桿菌(52%G+C)粘質(zhì)沙雷菌(58%G+C)草分枝桿菌(66%G+C)當(dāng)前第5頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆熔解溫度(meltingtemperature，Tm)：指50％DNA雙鏈變性時(shí)的溫度，也稱解鏈溫度或變性溫度。此時(shí)溶液的紫外吸收值達(dá)到最大值的一半。DNA的熱變性變性比率％()501000758085溫度(℃)TmTm當(dāng)前第6頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆影響Tm值的因素：①DNA的均一性均一DNA解鏈溫度范圍較不均一DNA窄②DNA中的G+C含量

Tm＝69.3＋0.41·x(G+C)

x(G+C)為(G+C)的摩爾分?jǐn)?shù)③溶劑的性質(zhì)離子強(qiáng)度低，Tm較低，且溶解溫度范圍窄當(dāng)前第7頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆核酸分子雜交(hybridization)：兩個(gè)不同來源、具有互補(bǔ)堿基序列的單鏈核酸分子形成雙鏈核酸分子的過程?；旌虾髲?fù)性核酸雜交雜合雙鏈當(dāng)前第8頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆退火(annealing)：DNA在熱變性后，經(jīng)緩慢冷卻，并將溫度維持在一定范圍(一般比Tm低25~30℃左右)時(shí)，單鏈DNA可重新恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)。2.核酸分子雜交中的探針(probe)(1)核酸探針的概念◆能與特定的靶分子(DNA或RNA)發(fā)生特異性結(jié)合的核酸分子。當(dāng)前第9頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)(2)核酸探針的種類與應(yīng)用◆據(jù)探針的來源和性質(zhì)：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針及寡核苷酸探針。◆探針應(yīng)用原則：探針與被檢測(cè)的目的核酸之間在核苷酸序列上要具有高度的特異性。①基因組DNA探針◆根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇基因組中的一段DNA序列，并將此DNA序列克隆至工程菌經(jīng)擴(kuò)增后可獲得大量探針。當(dāng)前第10頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)②cDNA探針◆cDNA(complementaryDNA)：以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的能與模板互補(bǔ)的DNA鏈?！鬰DNA探針無內(nèi)含子，尤適用于基因表達(dá)的檢測(cè)。③RNA探針◆通常利用體外轉(zhuǎn)錄體系，以cDNA為模板制備?！魞?yōu)點(diǎn)是探針為單鏈，具有很高的雜交效率?！羧秉c(diǎn)是RNA易于降解，標(biāo)記方法復(fù)雜。當(dāng)前第11頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)④寡核苷酸探針◆在體外經(jīng)人工合成的單鏈DNA分子，可與靶分子中的一段序列互補(bǔ)。(3)核酸探針的標(biāo)記①標(biāo)記物◆同位素標(biāo)記物：32P、3H、35S、14C、125I、131I?！舴欠派湫詷?biāo)記物：地高辛、生物素和熒光素。當(dāng)前第12頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)32P及35S標(biāo)記的NTP結(jié)構(gòu)圖4Li＋dUTP連接臂敏感性酯鍵地高辛甾醇半抗原Dig-dUTP當(dāng)前第13頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)Ⅰ.用T4多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記

Ⅱ.切口平移法

Ⅲ.隨機(jī)引物法

Ⅳ.粘性末端法

Ⅴ.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法②標(biāo)記方法(4)標(biāo)記探針的檢測(cè)①放射自顯影技術(shù)②免疫法檢測(cè)當(dāng)前第14頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)3.核酸雜交常用方法(1)Southern雜交(Southernblotting)◆也稱Southern印跡，由E.M.Southern發(fā)明，本質(zhì)為DNA-DNA雜交，基本過程為：限制酶消化電泳強(qiáng)堿變性轉(zhuǎn)膜雜交洗膜曝光或顯色當(dāng)前第15頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)重物吸水紙膜凝膠塑料膜濾紙緩沖液固相支持物雜交洗膜曝光Southern雜交圖解限制酶消化凝膠電泳當(dāng)前第16頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)植物限制酶消化圖譜DNA當(dāng)前第17頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)Dig標(biāo)記探針的雜交結(jié)果當(dāng)前第18頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)放射自顯影照片當(dāng)前第19頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)(2)Northern雜交(Northernblotting)◆也稱為Northern印跡，本質(zhì)為利用DNA探針分析RNA樣品，基本過程為：分離純化RNA電泳轉(zhuǎn)膜雜交洗膜曝光或顯色變性當(dāng)前第20頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)在生物芯片(biochip)中采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子有序地固化于支持物表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。此類技術(shù)又被統(tǒng)稱為微陣列。(3)微陣列(microarray)當(dāng)前第21頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)DNA微陣列實(shí)驗(yàn)流程圖：陣列的制作(將確認(rèn)后的序列自動(dòng)印制在載玻片或膜上)靶標(biāo)的制備(樣品的提取與標(biāo)記)雜交掃描檢測(cè)結(jié)果分析DNA微陣列(芯片)的應(yīng)用：新基因發(fā)現(xiàn)、基因診斷、藥物篩選、個(gè)性化給藥當(dāng)前第22頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)酵母在孢子形成期基因表達(dá)分析當(dāng)前第23頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)(4)原位雜交(insituhybridization)◆在細(xì)胞和組織內(nèi)的原始位置進(jìn)行雜交檢測(cè)，靶序列無需分離或純化。◆包括染色體原位雜交和組織原位雜交兩類?！敉ǔＳ糜诙ㄎ话麧{內(nèi)mRNA，分析基因表達(dá)?！艋静襟E：組織切片雜交洗滌顯微觀察當(dāng)前第24頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆染色體原位雜交是在染色體上定位基因或DNA序列：染色體顯微片(干燥)除RNA和蛋白質(zhì)變性DNA洗滌觀察分析雜交當(dāng)前第25頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)4.

核酸分子雜交的應(yīng)用：核酸雜交遵循堿基配對(duì)原則，決定了核酸雜交的特異性；此外核酸雜交可以在DNA與DNA、DNA與RNA及RNA與RNA之間進(jìn)行，

(1)基因表達(dá)檢測(cè)

(2)從基因組文庫或cDNA文庫中篩選特定克隆

(3)基因在染色體中的定位

(4)疾病診斷等當(dāng)前第26頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)二、其它分子雜交技術(shù)

1.蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)◆又稱免疫印跡(immunoblotting)，其原理是抗原抗體的特異性結(jié)合?！艋静襟E：電泳分離蛋白樣品電轉(zhuǎn)膜與一抗反應(yīng)與二抗反應(yīng)顯色反應(yīng)當(dāng)前第27頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆二抗可用酶、生物素或熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。◆ELISA(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)：是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種高度特異性試驗(yàn)分析技術(shù)。當(dāng)前第28頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)2.凝膠滯留法(gelretardationassay)◆又叫遷移率改變法(mobilityshiftassay)，是檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的一種簡(jiǎn)單靈敏的方法。◆基本原理：蛋白質(zhì)可與DNA形成復(fù)合物，在進(jìn)行PAGE電泳檢測(cè)時(shí)，這些復(fù)合物比游離的DNA慢很多形成一個(gè)滯后帶。當(dāng)前第29頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)Section2PolymeraseChainReaction當(dāng)前第30頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)一、PCR基本原理◆是在熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化下的體外DNA合成的循環(huán)反應(yīng)?！鬚CR反應(yīng)體系：DNA模板、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶、引物、四種dNTP和Mg2＋?！鬚CR反應(yīng)三個(gè)基本過程：

(1)變性：利用高溫(~95℃)使雙鏈解開。

(2)退火：在低溫(25~65℃)下使引物與模板配對(duì)。

(3)延伸：在~72℃利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化DNA合成。當(dāng)前第31頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)模板DNA引物dNTPTaqDNAPol變性退火延伸PCR循環(huán)當(dāng)前第32頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆PCR反應(yīng)三個(gè)基本過程可以不斷循環(huán)，從而使體系內(nèi)DNA的量呈指數(shù)增長(zhǎng)。變性退火延伸變性退火延伸循環(huán)1循環(huán)2經(jīng)過多輪PCR當(dāng)前第33頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)二、PCR反應(yīng)試劑1.模板

(1)模板DNA用量少，一般使用102~105拷貝

(2)有一定的純度要求

(3)對(duì)模板的序列有一定了解2.引物◆引物為一段寡核苷酸序列?！裘織l引物的典型濃度約0.1~0.5μmol/L當(dāng)前第34頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)◆引物設(shè)計(jì)一般原則：

(1)為待擴(kuò)增序列兩端的已知序列

(2)長(zhǎng)度一般為18-30個(gè)寡核苷酸

(3)G+C含量合理：40~60%，Tm＝4(G+C)＋2(A+T)(4)在3'末端避免富含G或C(5)避免引物二聚體的形成

(6)避免引物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)

(7)在5'端可引入限制位點(diǎn)當(dāng)前第35頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)3.DNA聚合酶◆熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，從嗜熱菌可獲得?！艟酆厦傅倪x擇以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑橐罁?jù)常用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶酶最佳溫度(℃)外切酶活性保真度Taq75~805'→3'低Tfl70－低Pfu72~783'→5'高DeepVent70~803'→5'高Pwo60~653'→5'高◆聚合酶的濃度通常為2~2.5U/100μl。當(dāng)前第36頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)4.dNTP◆高濃度的dNTP對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)具有抑制作用，甚至引起聚合酶的錯(cuò)配，一般將濃度控制在200μmol/L左右。5.Mg2＋◆Mg2＋濃度高會(huì)引起非特異性產(chǎn)物增加，Mg2＋濃度低，會(huì)使聚合酶活性降低，一般控制在0.5~2.5mmol/L當(dāng)前第37頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)6.pH緩沖體系◆標(biāo)準(zhǔn)PCR體系常使用10mmol/L的Tris-HCl(pH8.3-8.8)

緩沖體系，反應(yīng)時(shí)由于溫度升高體系的pH值可回落至7.2左右。7.一價(jià)陽離子◆標(biāo)準(zhǔn)PCR體系常使用50mM的KCl，對(duì)于擴(kuò)增500bp

以上的片段有利，調(diào)整至70~100mmol/L時(shí)，對(duì)擴(kuò)增較短片段有利。當(dāng)前第38頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)三、PCR循環(huán)1.標(biāo)準(zhǔn)PCR循環(huán)包括變性、退火和延伸三步：變性：94-96℃退火：55-65℃延伸：~72℃重復(fù)25~35次當(dāng)前第39頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)2.PCR循環(huán)效率

◆與聚合酶活力直接相關(guān)：

Nf＝N0(1+Y)n

Nf為n次循環(huán)后的擴(kuò)增序列拷貝數(shù)

N0為靶序列的起始拷貝數(shù)

Y為擴(kuò)增效率，n為循環(huán)數(shù)若Y＝100％，則：Nf＝N0·2n

◆

當(dāng)靶序列拷貝數(shù)達(dá)1012時(shí)，聚合酶成為擴(kuò)增限制性因素當(dāng)前第40頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)1.目的基因的克隆2.基因的體外突變3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列測(cè)定5.基因突變分析四、PCR的主要應(yīng)用當(dāng)前第41頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)五、反轉(zhuǎn)錄PCR(ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)1.RT-PCR過程以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA鏈，并用以進(jìn)行常規(guī)PCR。RNA→cDNA→dsDNA→PCR當(dāng)前第42頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)正義引物更多PCR循環(huán)RNARNARNADNADNADNADNA反義引物當(dāng)前第43頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)2.RT-PCR的應(yīng)用(1)定量分析mRNA，測(cè)定基因表達(dá)強(qiáng)度(2)構(gòu)建大容量的cDNA文庫(3)鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否已經(jīng)發(fā)生突變當(dāng)前第44頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)六、實(shí)時(shí)定量PCR(realtimePCR)◆使用熒光試劑標(biāo)記PCR產(chǎn)物，可對(duì)模板量(基因拷貝數(shù))和PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，具有很好的可靠性。◆實(shí)時(shí)定量PCR包括兩種：

(1)通過插入熒光染料進(jìn)行定量，如SYBRGreen(2)利用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行定量，如

TaqMan探針當(dāng)前第45頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)SYBR與dsDNA結(jié)合，在受到激發(fā)時(shí)，可發(fā)出綠色熒光。當(dāng)前第46頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第47頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第48頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第49頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)第三節(jié)DNA測(cè)序Section3DNASequencing當(dāng)前第50頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)一、雙脫氧鏈終止法

(DideoxyChainTerminationMethod)◆雙脫氧鏈終止法由FredSanger(1977)所發(fā)明?！粼恚涸贒NA聚合反應(yīng)體系中加入ddNTP，使DNA的聚合進(jìn)程隨機(jī)終止，通過PAGE分析，直接讀出DNA序列?！綦p脫氧鏈終止法反應(yīng)體系組成：DNA模板(即待測(cè)序DNA)、DNA聚合酶、測(cè)序引物和dNTP(ddNTP和標(biāo)記dNTP)。雙脫氧鏈末端終止法(F.Sanger，1977)和化學(xué)裂解法(Maxam和Gilbert，1977)。當(dāng)前第51頁\共有58頁\編于星期五\17點(diǎn)ddNTPdNTPdNTP與ddNTP的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第52頁\共有58頁\編于星期五\17