流動(dòng)相對(duì)色譜峰形及保留值的影響

流動(dòng)相對(duì)色譜峰形及保留值的影響第一頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日pH應(yīng)用反相高效液相色譜進(jìn)行分析測(cè)定時(shí)，常常采用離子抑制法即向含水流動(dòng)相中加入酸、堿或緩沖溶液等改性劑，以使流動(dòng)相的pH值控制一定數(shù)值，抑制溶質(zhì)的離子化，減少譜帶拖尾、改善峰形，以提高分離的選擇性。例如在分析有機(jī)弱酸時(shí)，常向流動(dòng)相中加入磷酸(或乙酸、三氯乙酸、甲酸、硫酸)，就可抑制溶質(zhì)的離子化，獲對(duì)稱的色譜峰。對(duì)于弱堿性樣品，向流動(dòng)相中加入三乙胺，也可達(dá)到相同的效果。方法建立時(shí)最好選用pH微小改變不影響分離的流動(dòng)相，pH值的較大變化往往會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生很大影響，因此流動(dòng)相pH值的調(diào)節(jié)是分析過(guò)程中至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。第二頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日將常用藥物按它們對(duì)流動(dòng)相pH值變化的保留值函數(shù)特征分成堿性、酸性和中性三類,有利于從宏觀上把握藥物的色譜行為趨勢(shì),可以有預(yù)見(jiàn)性地規(guī)劃分離條件的選擇,減少不必要的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)次數(shù),對(duì)內(nèi)標(biāo)物的選擇及分離度的改善和保留值的增減趨勢(shì)均可作出事先的判斷,這對(duì)在藥物分析實(shí)踐中有指導(dǎo)意義。第三頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日式中k′p、k′p+1是pH值分別為p、p+1時(shí)的容量因子,n為pH2-5時(shí)的pH值,Sp、Spn為流動(dòng)相pH值增加±1時(shí)藥物容量因子的響應(yīng)系數(shù)和平均響應(yīng)系數(shù)。定義:Spn>0.1,物質(zhì)為堿性,保留值隨pH值增加而增加;Spn<-0.1,物質(zhì)為酸性,保留值隨pH值增加而減少;-0.1≤Spn≤0.1,物質(zhì)保留值幾乎不受流動(dòng)相pH值變化的影響,被定義為中性?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)是藥物理化特性、色譜特征的物質(zhì)基礎(chǔ),不同結(jié)構(gòu)的藥物表現(xiàn)出不同的色譜行為。堿性藥物均含有未參予共扼體系的氮原子,

酸性藥物含羧基或磺酸基團(tuán),

中性藥物不含酸堿基團(tuán),如甾體類和酰胺類第四頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日酸性煙酸阿魏酸卡托普利蔡普生布洛芬對(duì)氨基水楊酸甘草酸水楊酸堿性普羅帕酮法莫替丁阿替洛爾利多卡因苯丙哌林環(huán)丙沙星維拉帕米氯丙嗪中性茶堿維生素c非那西丁卡馬西平硝苯地平地西泮阿昔洛維第五頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日有的藥物在結(jié)構(gòu)上同時(shí)含有酸性、堿性基團(tuán),卻表現(xiàn)出不同色譜行為。如環(huán)丙氟呱酸和氨甲苯酸呈堿性,丙谷胺為酸性,而氟呱酸卻類似中性。磺胺類藥物多為中性或呈弱堿性。一般來(lái)說(shuō),堿性藥物的保留值對(duì)pH值的敏感性差異較大,保留值大的藥物對(duì)pH值的敏感性較大,堿性藥物對(duì)pH值敏感性在pH>4時(shí)顯著增加,如酮康哇和益康哇。所以當(dāng)分離堿性或酸性藥物采用的流動(dòng)相pH值在4左右時(shí),要特別給予注意,以免影響分離度和峰序的改變,如環(huán)丙沙星與氟哌啶,地卡因與普羅帕酮等在一之間發(fā)生峰序倒置。第六頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日如果水未冷卻到室溫就調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，會(huì)造成流動(dòng)相pH值的較大偏離，從而導(dǎo)致整個(gè)色譜分析實(shí)驗(yàn)的偏差甚至失敗。pH>8,硅膠基質(zhì)的溶解

pH<2,鍵合相基團(tuán)脫落調(diào)節(jié)水相第七頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日離子強(qiáng)度在反相高效液相色譜過(guò)程中,流動(dòng)相的離子強(qiáng)度可顯著影響可解離的化合物的色譜峰形。過(guò)載（overloading），峰形接近直角三角形。隨著進(jìn)樣量的增加,色譜區(qū)帶中高濃度的前半部的保留時(shí)間減少,但色譜區(qū)帶均在同一時(shí)刻結(jié)束,色譜峰的拖尾因子及峰寬均顯著增加,同時(shí)被測(cè)物與有關(guān)物質(zhì)間的分離也隨之變差。選擇合適的緩沖鹽并適當(dāng)?shù)卦黾恿鲃?dòng)相的離子強(qiáng)度即可顯著改善色譜峰形,色譜峰的拖尾因子及峰寬均隨之降低,同時(shí)被測(cè)物與有關(guān)物質(zhì)間也更加易于分離。第八頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日overloading以硅膠為基質(zhì)的反相鍵合相填料的表面實(shí)際上是不均勻的,固定相中不可避免地含有少量高能量位點(diǎn)(sites),這些高能量位點(diǎn)易被可解離的(甚至中性的)化合物所過(guò)載。解離的化合物在固定相表面的相互排斥作用以及較難滲透進(jìn)入疏水性的固定相中也是可能的原因，采用反相高效液相分離可解離的(尤其是堿性的)化合物時(shí)色譜柱易于過(guò)載,甚至低達(dá)10ng的堿性化合物也可使常規(guī)色譜柱的表觀柱效明顯降低;減少進(jìn)樣量則可改善色譜峰形并使表觀柱效顯著增加;過(guò)載效應(yīng)可隨著流動(dòng)相的離子強(qiáng)度的增加而逐漸減弱。第九頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日分離可解離的化合物時(shí),流動(dòng)相中添加緩沖鹽并非僅僅用于穩(wěn)定流動(dòng)相的pH值,緩沖鹽、甚至簡(jiǎn)單的中性鹽（如氯化鈉）的反離子還可與離子化的被測(cè)物通過(guò)相互間的締合作用形成疏水性較強(qiáng)的中性離子對(duì)復(fù)合物;在低離子強(qiáng)度的緩沖液中,吸附在固定相表面的離子化的被測(cè)物分子的極性基團(tuán)相互之間存在靜電排斥效應(yīng),這使得色譜柱的飽和容量顯著降低;隨著緩沖液濃度(離子強(qiáng)度)的增加,中性離子對(duì)復(fù)合物的濃度相應(yīng)增加,固定相表面離子化的吸附物之間的相互排斥作用隨之減弱,導(dǎo)致色譜柱的飽和容量、尤其是填料上的低能量位點(diǎn)的飽和容量以及平衡常數(shù)增加;鹽一類的流動(dòng)相添加劑可破壞離子化的被測(cè)物在流動(dòng)相中的溶劑化-去溶劑化平衡,產(chǎn)生所謂的促溶效應(yīng)(chaotropiceffect),被測(cè)物與鹽相互作用,離子化的被測(cè)物相互間的排斥作用減弱,從而顯著地影響被測(cè)物在固定相上的吸附行為;在制備色譜系統(tǒng)中或被測(cè)物濃度較高時(shí),流動(dòng)相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰形和分離效果。第十頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日色譜柱的飽和容量可隨緩沖鹽的單價(jià)陽(yáng)離子(如Na+

、NH4+

、K+

、Cs+)直徑的增加而降低,選用Na+,色譜柱的飽和容量相對(duì)較高。生物堿：乙腈-KH2PO4第十一頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日甲醇∶KH2PO4

（0.01M，pH4.3）=60∶40甲醇∶KH2PO4

（0.1M，pH4.3）=50∶50甲醇∶KH2PO4

（0.1M，pH3.5）=50∶50青霉素G濃度2.0,1.0,0.4,0.2mg/mL第十二頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日克林霉素濃度2.0,1.0,0.4,0.2mg/mL甲醇∶NH4H2PO4(0.025M)=55∶45甲醇∶NH4H2PO4(0.135M)=53∶47第十三頁(yè)，共十五頁(yè)，編輯于2023年，星期日甲醇乙腈之比較吸光度比較乙腈和甲醇吸收光譜，乙腈吸收較?。ㄌ貏e是在短波長(zhǎng)）。壓力甲醇與水混合，壓力增高；乙腈在同樣的流速下不在柱內(nèi)加上多余的壓力。洗脫能力混合比率低時(shí)，乙腈的洗脫能力強(qiáng)。有機(jī)溶劑100%或與此極接近時(shí)，常常都是甲醇的洗脫能力強(qiáng)。分離(洗脫)的選擇性有機(jī)溶劑分子的化學(xué)性質(zhì)(甲醇和乙醇是質(zhì)子性，乙腈和四氫呋喃是非質(zhì)子性)不同所致。因此，在用乙腈類不能獲得分離的選擇性，就試用甲醇類看看。流動(dòng)相的脫氣甲醇與水混合時(shí)發(fā)熱，多余的溶解空氣較易變?yōu)槊摮鰵馀?脫氣容易)。而乙腈由于吸熱冷卻，