核酸分子雜交及芯片技術

教學內容核酸分子雜交的基本原理核酸探針核酸分子雜交技術方法

DNA芯片技術當前第1頁\共有68頁\編于星期五\10點1、變性（denaturation）

在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團，雙鏈解鏈成為單鏈。無共價鍵斷裂。當前第2頁\共有68頁\編于星期五\10點2、融解溫度（Tm值）：

在DNA熱變性時，其A260的升高達最大值一半時的溫度。當前第3頁\共有68頁\編于星期五\10點影響Tm的因素：

（1）DNA堿基的組成

G-C含量越多Tm值越高

A-T含量越多Tm值越低當前第4頁\共有68頁\編于星期五\10點（2）溶液的離子強度

低離子強度Tm值越低

高離子強度Tm值越高（3）pH值

pH值5-9Tm值變化不明顯

pH<4pH>11不利于氫鍵形成

（4）變性劑

干擾堿基堆積力和氫鍵的形成當前第5頁\共有68頁\編于星期五\10點3、復性

變性DNA經過一定處理通過堿基互補重新形成雙螺旋的過程。二級反應動力學通過隨機碰撞配對緩慢“拉鎖鏈”快當前第6頁\共有68頁\編于星期五\10點

DNA濃度

DNA片段的大小

DNA片段復雜性

合適的復性溫度

適當的離子強度影響復性速度的因素:當前第7頁\共有68頁\編于星期五\10點可逆性(非共價結合)序列特異性(堿基互補配對)紫外吸收黏度沉降系數比旋度生物活性淬火退火掌握概念應用：探針單鏈化核酸的變性與復性特點當前第8頁\共有68頁\編于星期五\10點4、雜交

根據核酸變性和復性的原理，兩條來源不同，但具有互補序列的核酸，按堿基配對原則復性形成一個雜交體，這個過程即雜交，或稱分子雜交。分類

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA高度特異的允許一定程度的錯配嚴格度當前第9頁\共有68頁\編于星期五\10點

當前第10頁\共有68頁\編于星期五\10點教學內容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針核酸分子雜交技術方法

DNA芯片技術當前第11頁\共有68頁\編于星期五\10點一、概念

探針（probe）

指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測的分子。

例如抗原-抗體、生物素-親和素等均可看成是探針與靶分子的相互作用。

當前第12頁\共有68頁\編于星期五\10點核酸探針

指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補雜交，雜交后又能被特殊方法檢測的已知被標記（同位素或非同位素標記）的核苷酸鏈。靶分子：核酸（DNAorRNA）核酸探針:1.與靶核酸分子特異互補的核苷酸鏈。2.被標記，能被特殊方法檢測。實質：通過檢測探針上的標志物來反應靶分子的存在與否以及量的多少。當前第13頁\共有68頁\編于星期五\10點二、分類

根據性質和來源不同：

（1）基因組DNA探針

有內含子，雜交效率低

（2）cDNA探針

無內含子，適用于基因表達的檢測

（3）RNA探針

單鏈性，特異性高；不穩(wěn)定，易降解

（4）寡核苷酸探針

合成方便，靈敏度受長度限制稍差當前第14頁\共有68頁\編于星期五\10點二、分類

根據標記方法不同：

（1）放射性探針

（2）非放射性探針

當前第15頁\共有68頁\編于星期五\10點理想的核酸探針標記物應具備

①高度的敏感性

②標記物與探針結合后，不影響雜交時堿基配對及探針分子的主要理化性質；③檢測方法除有高靈敏性、高特異性、假陽性率低外，尚需考慮環(huán)境污染少，價格低；

④若用酶標記，應對酶的Km值影響不大，以保證標記反應的效率和標記產物的比活性。三、標記當前第16頁\共有68頁\編于星期五\10點（一）標記物

放射性同位素標記物

非放射同位素標記物

當前第17頁\共有68頁\編于星期五\10點

1.放射性

常用的有32P/35S/3H。

特點：

檢測的靈敏度和特異性高

射線對人體有傷害

放射性物質需特殊的處理

半衰期短不宜存放使用

當前第18頁\共有68頁\編于星期五\10點2.非放射性標記物

常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、熒光素、酶。

特點：

敏感性不如同位素標記

穩(wěn)定性高、檢測時間短

操作簡便

不需特殊的防護設備

不存在放射性污染當前第19頁\共有68頁\編于星期五\10點（二）標記法

酶反應法

將標記物（放射或非放射）預先標記在核苷酸分子上，然后通過酶促反應將標記的核苷酸分子滲入探針分子中?；瘜W反應法

利用標記物(非放射為主)分子上的活性基團與核酸分子上的基團發(fā)生化學反應而將標記物結合到探針分子上。當前第20頁\共有68頁\編于星期五\10點1、隨機引物法（randompriming）

利用DNA聚合酶來合成與模板互補的新的DNA鏈。

將6-8寡核苷酸片段與已變性的DNA單鏈或RNA模板退火，使該片段隨機互補結合在單鏈分子上，在大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下，以同位素標記的dNTP為原料，寡核苷酸為引物的3’-OH端開始沿5’至3’方向，合成一條與模板互補的新DNA鏈。當前第21頁\共有68頁\編于星期五\10點隨機引物（6-8nt）：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=409648=65536DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性無5’→3’外切核酸酶活性鏈替代，比活高隨機引物法（randompriming）當前第22頁\共有68頁\編于星期五\10點

2、切口平移法

◆胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機切開若干切口，切口處形成3’-OH末端。

◆大腸桿菌DNA聚合酶I以切口處開始作用，以另一條DNA鏈為模板。

◆4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修復加入標記核苷酸同時進行，切口平行推移。

生成的兩條鏈都被同位素均勻標記。當前第23頁\共有68頁\編于星期五\10點大腸桿菌DNA聚合酶I的活性種類？5’3’聚合酶活性3’

5’外切酶活性5’3’

外切酶活性當前第24頁\共有68頁\編于星期五\10點大腸桿菌DNA聚合酶I

（1）5’3’聚合酶活性標記當前第25頁\共有68頁\編于星期五\10點（2）3’5’外切酶活性當前第26頁\共有68頁\編于星期五\10點（3）5’3’外切酶活性切口平移當前第27頁\共有68頁\編于星期五\10點

5’->3’外切酶活性使缺口平移5’->3’聚合酶活性上游鏈延伸而被標記當前第28頁\共有68頁\編于星期五\10點3.末端標記法

末端標記法是將標記物導入線型DNA或RNA的5’端或3’端的一類標記法。

5’端標記法

3’端標記法當前第29頁\共有68頁\編于星期五\10點（1）5’端標記法（T4多聚核苷酸激酶）

用堿性磷酸酶切除DNA雙鏈分子或RNA單鏈5’末端的磷酸基團，使其成為5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，經T4多聚核苷酸激酶催化，將γ位上的32P轉移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均帶32P標記。當前第30頁\共有68頁\編于星期五\10點T4多聚核苷酸激酶催化當前第31頁\共有68頁\編于星期五\10點（2）3’端標記法（大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段）

大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但無5’→3’外切酶活性。對殘缺3’末端可進行標記。

末端的性質？當前第32頁\共有68頁\編于星期五\10點當前第33頁\共有68頁\編于星期五\10點教學內容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針

核酸分子雜交技術方法

DNA芯片技術當前第34頁\共有68頁\編于星期五\10點

核酸分子雜交↓

固相雜交液相雜交膜上印跡雜交核酸原位雜交核酸分子雜交的分類核酸分子雜交技術是一種信號放大技術。當前第35頁\共有68頁\編于星期五\10點一、膜上印跡雜交

印跡技術：將凝膠中待測的核酸分子轉移到一定的固相支持物上的方法。指將待測核酸序列結合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進行雜交的過程。當前第36頁\共有68頁\編于星期五\10點1．固相支持物的選擇常用的固相支持物：硝酸纖維膜（NC）尼龍膜PVDF膜（聚二氟乙烯膜）當前第37頁\共有68頁\編于星期五\10點2．印跡方法Methodsoftransfer虹吸印跡法（Capillary）真空轉移法（Vacuum）電轉移法（Electrophoretic）BlotDNAtomembrane當前第38頁\共有68頁\編于星期五\10點

CapillaryBlotting(upward)

nospecialequipmentrequired!1975年E.SouthernSouthernDNA印跡轉移技術DNA片段<1kb，1小時DNA片段>15kb，18小時當前第39頁\共有68頁\編于星期五\10點當前第40頁\共有68頁\編于星期五\10點Electrophoreticblotting不宜用硝酸纖維素膜一般2~3小時，最多6~8小時especiallygoodforsmallfragmentsresolvedbyPAGE當前第41頁\共有68頁\編于星期五\10點Vacuumblotting30~60分鐘moreefficientandquantitativethancapillarymustapplyvacuumevenlyandnottoostrongly當前第42頁\共有68頁\編于星期五\10點3．印跡類型Southern印跡雜交Northern印跡雜交斑點及狹縫印跡雜交菌落或噬菌斑雜交原位雜交當前第43頁\共有68頁\編于星期五\10點提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southernblottinghybridization預雜交當前第44頁\共有68頁\編于星期五\10點當前第45頁\共有68頁\編于星期五\10點Southern印跡雜交的應用：

檢測靶分子為DNA,檢測靶分子是否含有目的基因。

可用于基因組基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析、DNA指紋圖譜等。當前第46頁\共有68頁\編于星期五\10點Northern印跡雜交

應用DNA探針檢測特異mRNA的一種雜交技術，主要用于分析mRNA的轉錄或mRNA分子大小，其方法類似于Southern印跡雜交。

當前第47頁\共有68頁\編于星期五\10點RNA極易被RNase降解RNA酶抑制劑0.1%DEPC處理水(焦碳酸二乙酯)Northernblottinghybridization檢測靶分子為RNA，單鏈，探針制備時需注意是否與靶分子配對。當前第48頁\共有68頁\編于星期五\10點pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNANouthernblottinghybridization當前第49頁\共有68頁\編于星期五\10點優(yōu)點：簡單、迅速（直接點樣）；可在同一張膜上進行多個樣品的檢測；應用：同一種樣品經不同倍數的稀釋,可以得到半定量的結果；核酸粗提樣品的檢測效果也較好。Dotandslotblottinghybridization將變性后的DNA或RNA直接點樣于膜上當前第50頁\共有68頁\編于星期五\10點檢測的是基因組DNA還是mRNA?當前第51頁\共有68頁\編于星期五\10點Colonyorphagehybridization

從重組DNA文庫中篩選陽性克隆當前第52頁\共有68頁\編于星期五\10點核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）用標記的已知核酸序列為探針，與細胞涂片或組織切片中核酸進行雜交檢測的方法。每張標本所用雜交液較少，20~100μl，為了避免雜交液蒸發(fā)后造成雜交液濃縮，需使用密閉的濕盒。在組織或細胞內進行DNA或RNA精確定位和定量。當前第53頁\共有68頁\編于星期五\10點核酸原位雜交的基本步驟1.細胞或組織的固定：載玻片2.組織細胞雜交前的預處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質3.探針的選擇和標記4.雜交5.雜交結果檢測當前第54頁\共有68頁\編于星期五\10點探針與分裂中期染色體DNA雜交，研究特定核酸序列在染色體中的精確定位；探針與細胞內RNA進行雜交，觀察該組織細胞中特定基因的表達水平；用特異性的細菌、病毒的核酸作為探針對組織細胞進行雜交，確定有無該病原體的感染。應用：當前第55頁\共有68頁\編于星期五\10點FISH(熒光原位雜交)結果地高辛標記的探針用抗地高辛-羅丹明顯示(紅色)生物素標記的探針，用抗生物素蛋白-FITC顯示(綠色)當前第56頁\共有68頁\編于星期五\10點1.熒光染色體原位雜交(FluorescenceinsituHybridization；FISH)

基本原理是將DNA探針用熒光染料標記，然后將標記的探針直接原位雜交到染色體上，來檢測DNA序列在染色體上的定位。

2.比較基因組原位雜交(ComparativeGenomicHybridization；CGH)由原位雜交發(fā)展起的一些新技術自學當前第57頁\共有68頁\編于星期五\10點雜交基本流程（一）核酸分子與固相介質的結合

1.噬菌體/克隆的轉移

2.從凝膠上轉移DNA:毛細轉移、真空轉移、電轉移（二）核酸的固定：烘烤（80℃，2h）、紫外、堿（三）雜交：預雜交、雜交、洗脫（四）雜交信號的檢測：放射自顯影、非放射性雜化分子的檢測當前第58頁\共有68頁\編于星期五\10點核酸分子的濃度和長度：50～300bp,0.1～0.5g2.溫度:Tm-25℃3.離子強度:Na+濃度約為1mol/L4.雜交液中的甲酰胺:50%甲酰胺,降低Tm5.核酸分子的復雜性6.非特異性雜交反應:封閉影響雜交的因素當前第59頁\共有68頁\編于星期五\10點常用封閉物：①變性非特異DNA：鮭魚精子DNA， 小牛胸腺DNA②高分子化合物：Denhardt溶液 脫脂奶粉當前第60頁\共有68頁\編于星期五\10點核酸雜交分類表雜交方法適用范圍Southern印跡檢測經凝膠電泳分開的DNA分子，需轉印到膜上Northern印跡檢測經凝膠電泳分開的RNA分子，需轉印到膜上斑點及狹縫印跡雜交檢測未經分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑雜交檢測固定在膜上的、經裂解后從細菌或噬菌體中釋放出的DNA分子原位雜交檢測細胞或組織中的DNA或RNA分子當前第61頁\共有68頁\編于星期五\10點教學內容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針

核酸分子雜交技術方法

DNA芯片技術當前第62頁\共有68頁\編于星期五\10點生物芯片技術采用類似集成電路制作中的微加工技術，將生命科學研究中的若干不連續(xù)過程（如樣品制備、生化反應、檢測和分析步驟）集成到一塊幾平方厘米的芯片上，使這些分散的過程連續(xù)化與微型化，實現對大量生物樣品中的各種數據的快速、自動和并行處理和分析。芯片技術當前第63頁\共