生物大分子相互作用分析技術基礎醫(yī)學與醫(yī)學實驗技術演示文稿

生物大分子相互作用分析技術基礎醫(yī)學與醫(yī)學實驗技術演示文稿當前第1頁\共有90頁\編于星期四\19點

第一節(jié)生物大分子相互作用分析的意義第二節(jié)常見的生物大分子相互作用分析方法第三節(jié)生物大分子相互作用分析新進展（FRET、SPR）主要內容當前第2頁\共有90頁\編于星期四\19點真核生物細胞

eukaryoticcell原核生物細胞prokaryoticcell細胞結構cell引言當前第3頁\共有90頁\編于星期四\19點原核生物細胞結構肽聚糖被膜質膜引言當前第4頁\共有90頁\編于星期四\19點動物細胞植物細胞細胞壁、細胞膜、細胞質和細胞核真核生物細胞結構引言當前第5頁\共有90頁\編于星期四\19點細胞中的大分子

MacromoleculesinCellsTheapproximatecompositionofabacterialcell.引言當前第6頁\共有90頁\編于星期四\19點分子水平DNAsequenceProteinsStructureFunction?AllCell

第一節(jié)生物大分子相互作用分析的意義當前第7頁\共有90頁\編于星期四\19點DNAPrimarytranscriptmRNAmRNAInactivemRNAproteinnucleuscytoplasmTranscriptionalcontrolPost-transcriptionalcontrolmRNAdegradationcontroltranslationcontrolactiveproteinPost-translationcontrol基因表達的調控層次當前第8頁\共有90頁\編于星期四\19點ProteincomplexSignalingnetwork生命機制當前第9頁\共有90頁\編于星期四\19點蛋白質組學的分類

表達蛋白質組學Quantitativestudyofproteinexpressionbetweensamplesthatdifferbysomevariable

結構基因組學Goalistomapoutthe3-Dstructureofproteinsandproteincomplexes

功能蛋白質組學Tostudyprotein-proteininteraction,3-Dstructures,cellularlocalizationandPTMsinordertounderstandthephysiologicalfunctionofthewholesetofproteome.當前第10頁\共有90頁\編于星期四\19點蛋白質結構和序列特點蛋白質進化過程和保守序列蛋白質表達譜蛋白在細胞內的定位及其相關聯的細胞器或結構蛋白質翻譯后修飾情況了解與其相關聯的其他細胞蛋白質蛋白質信息的不同層次當前第11頁\共有90頁\編于星期四\19點蛋白質同源二聚體(homodimer)蛋白質異源二聚體(heterodimer)蛋白質多聚體(polymer)蛋白質-DNA復合物(protein-DNAcomplex)蛋白質-脂質復合物(protein-lipidcomplex)蛋白質-RNA復合物(protein-RNAcomplex)DNA-DNA復合物(DNA-DNAcomplex)……生物大分子復合物的類型當前第12頁\共有90頁\編于星期四\19點第二節(jié)生物大分子相互作用分析技術

1.研究思路2.分類3.技術介紹當前第13頁\共有90頁\編于星期四\19點生物大分子相互作用分析研究思路鑒定與目標分子相互作用的所有可能大分子詳細描述其生物功能及相互作用對其功能的影響鑒定出相互作用且在生理狀態(tài)下得到了驗證和合理的解釋當前第14頁\共有90頁\編于星期四\19點當前第15頁\共有90頁\編于星期四\19點GST融合蛋白技術(GSTpull-down)免疫共沉淀(Immunoprecipitation,Co-IP

)串聯親和純化(TandemAffinityPurification，TAP)酵母雙雜交系統(Yeasttwo-hybrid)噬菌體展示(Phagedisplay)細胞內蛋白質共定位(Co-localization)熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)表面等離子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)……生物大分子相互作用分析技術當前第16頁\共有90頁\編于星期四\19點1.GST融合蛋白技術（GSTpull-downassay）——基于重組蛋白表達純化技術的體外分析系統基本原理：是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結合物后通過SDS電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。GST：谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathioneS-transferase)當前第17頁\共有90頁\編于星期四\19點GSTpull-downassayPurificationofproteinGlutathionecolumnGlutathionebeadGSTfusionprotein當前第18頁\共有90頁\編于星期四\19點TagsPull-Down

方法的組成RtagbaitpreyResin——樹脂Bait——誘餌蛋白Prey——捕獲蛋白Tags——標簽（GST,His,Flag,HA,MBP）當前第19頁\共有90頁\編于星期四\19點RPull-downexperimentRWashRRAddpreyWashElutionAnalysisBaitPreyControlsRAddpreyWashRRElutionAnalysisSCSDSgel實驗設計思路當前第20頁\共有90頁\編于星期四\19點GSTXY谷胱甘肽-瓊脂糖微珠細胞裂解物tube4℃下孵育2h

GST融合蛋白GSTXY+實驗流程當前第21頁\共有90頁\編于星期四\19點GSTpull-down

應用鑒定未知相互作用的蛋白鑒定預測的或已知的相互作用當前第22頁\共有90頁\編于星期四\19點GSTpulldown驗證兩種已知蛋白質（X-Y）的相互作用舉例inputGSTY-GFP+++X-GSTY-GFP105kDAnti-GFPX-GFP+++GSTinputAnti-GFPY-GSTX-GFP當前第23頁\共有90頁\編于星期四\19點2.免疫共沉淀（immunoprecipitation，Co-IP）——非常有效地用于鑒定細胞內生理上的蛋白質相互作用的分析技術

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當前第24頁\共有90頁\編于星期四\19點

基本原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。

GagaroseGagaroseXYGagarose當前第25頁\共有90頁\編于星期四\19點實驗設計思路當前第26頁\共有90頁\編于星期四\19點實驗流程SDSProteinA/GSepharose＋＋誘餌蛋白質抗體離心誘餌蛋白質ProteinA/GSepharose離心傳統方法交聯方法當前第27頁\共有90頁\編于星期四\19點基礎：細胞在非變性條件下裂解時，完整細胞內許多蛋白質之間的結合保持下來。要求：在一系列操作過程中保持蛋白質復合體不變缺點：可能檢測不到細胞內處于動態(tài)平衡中的低親和與瞬間的相互作用,存在著免疫球蛋白的污染，需要培養(yǎng)大量的細胞局限：僅應用于從細胞中溶解出來仍存在于生理復合物中的蛋白質當前第28頁\共有90頁\編于星期四\19點Co-IP

應用鑒定已知蛋白質相互作用的檢測鑒定新蛋白質間的相互作用當前第29頁\共有90頁\編于星期四\19點免疫共沉淀驗證兩種已知蛋白質的相互作用Y-GFPY-GFP+X-HAIP:HAcontrolIgGAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAY-GFPinput舉例當前第30頁\共有90頁\編于星期四\19點3.串聯親和純化（TandemAffinityPurification，TAP）a.One-stepaffinitypurificationb.Two-stepaffinitypurification(tandemaffinitypurification)Affinitypurification(immunopurification)——融合了標準生化純化和免疫共沉淀策略的極為有效的快速純化蛋白質復合物的方法當前第31頁\共有90頁\編于星期四\19點串聯親和純化技術的優(yōu)勢與傳統的生化純化方法相比與免疫共沉淀方法相比使用恒定的標簽和標準純化條件避免了每次都要設計新純化方案的問題多步驟純化降低了細胞高豐度蛋白質以及免疫球蛋白的背景污染當前第32頁\共有90頁\編于星期四\19點雙親和標簽：ProA（葡萄球菌蛋白A的兩個免疫球蛋白IgG結合單位）

CBP（鈣調蛋白結合肽）實驗設計思路當前第33頁\共有90頁\編于星期四\19點實驗流程鈣調素結合肽TEV酶切位點在Ca2+

離子下結合TEV酶切用EGTA洗脫靶蛋白結合于IgG珠子充分洗滌后，在TEV蛋白酶作用下洗脫結合物鈣離子存在下，將首次洗脫物中的蛋白質結合于鈣調蛋白包被的珠子上充分洗滌后，加入EGTA洗脫結合物當前第34頁\共有90頁\編于星期四\19點4.酵母雙雜交（yeasttwo-hybridsystem）——基于在轉錄水平上的直接在酵母細胞內檢測蛋白質之間相互作用的遺傳學方法當前第35頁\共有90頁\編于星期四\19點基本原理：基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。

前者可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節(jié)的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節(jié)的基因的轉錄。二個結構域不但可在其連接區(qū)適當部位打開，仍具有各自的功能。而且不同兩結構域可重建發(fā)揮轉錄激活作用。酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。

典型的真核生長轉錄因子，如GAL4都含有二個不同的結構域：DNA結合結構域（DNA-bindingdomain，BD）和轉錄激活結構域（transcription-activatingdomain，AD）。當前第36頁\共有90頁\編于星期四\19點酵母雙雜交（yeasttwo-hybridsystem）三個基本組成部分表達誘餌蛋白的載體，誘餌即我們感興趣的蛋白，它和DNA結合結構域融合。2.表達靶蛋白的載體，靶蛋白可以是一個已知的蛋白，也可以是cDNA或基因組文庫編碼的蛋白。靶蛋白和轉錄激活結構域融合。3.一個或多個報告基因（如控制氨基酸合成的基因、大腸桿菌的lacZ基因等），位于DNA結合結構域識別的調控區(qū)的下游。ADDBDgene+reporterMeasurableproduct+DBDbaitADpreyDBDAD當前第37頁\共有90頁\編于星期四\19點實驗設計思路Target:未知蛋白或將研究對象+DNAbindingdomainBait:已知蛋白+activationdomainTarget與Bait可互換轉入同一個酵母菌中ConstructtargetplasmidandbaitplasmidTransformationScreeningDNAextractionDNAsequencing當前第38頁\共有90頁\編于星期四\19點YeastTwo-HybridAssaynucleushis-leu-trp-MeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBDADhisHISlacZ當前第39頁\共有90頁\編于星期四\19點優(yōu)勢：酵母雙雜交方法的優(yōu)勢及缺陷

采用酵母菌株敏感度高蛋白折疊易于篩選應用范圍廣缺陷：

核內作用假陽性假陰性轉化率當前第40頁\共有90頁\編于星期四\19點酵母雙雜交方法的應用高靈敏度地檢測蛋白－蛋白的相互作用確定蛋白相互作用的結構域或重要活性位點尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白尋找具有藥物治療作用的小分子肽尋找控制蛋白相互作用的化合物蛋白相互作用圖譜的繪制當前第41頁\共有90頁\編于星期四\19點舉例酵母雙雜交前準備工作雙酶切驗證21kb5kb3.5kb2kb1.5kbM1M:marker1:pGBKT7-BD-X構建誘餌質粒誘餌蛋白的表達X-BDGal4-BD檢測誘餌蛋白是否有毒性123Westernblot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生長曲線1.未轉化酵母2.BD-酵母3.X-BD-酵母當前第42頁\共有90頁\編于星期四\19點酵母雙雜交結果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade+3-AT（20mM）舉例SD/-Trp/-LeuGal4-BD+Y-ADX-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADX-BD+Gal4-AD當前第43頁\共有90頁\編于星期四\19點

X-β-半乳糖苷酶藍白斑顯色分析舉例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD當前第44頁\共有90頁\編于星期四\19點酵母雙雜交測序結果酵母雙雜交得到的陽性克隆子質粒經過DNA測序，由NCBI數據庫的BLAST檢索cDNA編碼的蛋白質舉例當前第45頁\共有90頁\編于星期四\19點5.噬菌體展示技術（Phagedisplay）——基于將某個蛋白與其遺傳信息之間直接聯系的篩選方法

噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。到目前為止，人們已開發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統等數種噬菌體展示系統。當前第46頁\共有90頁\編于星期四\19點特點

該技術的主要特點是將特定分子的基因型和表型統一在同一病毒顆粒內，即在噬菌體表面展示特定蛋白質，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結構基因。另外，這項技術把基因表達產物與親和篩選結合起來，可以利用適當的靶蛋白將目的蛋白或多肽挑選出來。當前第47頁\共有90頁\編于星期四\19點UsedforcloningforeigngenesamongotherapplicationsProteinsandpeptidesarefusedtotheCapsid(surface)ofthephageThecombinationofthephageandpeptideisknownasaFusionProtein實驗設計思路當前第48頁\共有90頁\編于星期四\19點phagesFilamentousphagesM13FdF1OthersT4λ當前第49頁\共有90頁\編于星期四\19點FilamentousphagesInfectmanygram-negativebacteriaCircularsinglestrandedDNAgenomeAbout6.4kb.p.Long,flexibletubestructureabout1μmlongand6.5nmindiameterReproducedandsecretedfrominfectedbacteriawithoutcellkillingorlysis(lysogenicphage)當前第50頁\共有90頁\編于星期四\19點(a)Adenovirus.(b)Rotavirus.(c)Influenzavirus(courtesyofGeorgeLeser).(d)Vesicularstomatitisvirus.(e)Tobaccomosaicvirus.(f)Alfalfamosaicvirus.(g)T4bacteriophage.(h)M13bacteriophage.M13噬菌體顆粒結構當前第51頁\共有90頁\編于星期四\19點M13噬菌體的生活史其裂解周期為：1)吸附(adsorption)2)侵入(entory)3)復制（生物合成biosynthesis）4)成熟(maturation)5)裝配(assembly)6)釋放(release)當前第52頁\共有90頁\編于星期四\19點絲狀噬菌體的基因及蛋白結構

pIII(406aa,5~8copies)pVIII(50aa,~2700copies)pVI(112aa,5~8copies)當前第53頁\共有90頁\編于星期四\19點載體的插入位點

當前第54頁\共有90頁\編于星期四\19點pIII和pVIII噬菌體展示系統pIII系統pVIII系統拷貝數少多多肽片段大小大<10個氨基酸親和力高低適用范圍常用于展示由cDNA和基因組序列編碼的多肽，范圍較廣展示小肽，范圍較窄當前第55頁\共有90頁\編于星期四\19點T7噬菌體展示篩選系統測序分析插入序列將噬菌體文庫鋪在固定的靶蛋白上洗脫未結合的噬菌體加入大腸桿菌，擴增和富集洗脫的噬菌體鋪富集文庫鋪盤分離單個克隆3~4輪篩選驗證實驗：結合實驗實驗流程當前第56頁\共有90頁\編于星期四\19點

優(yōu)點：

A.高通量的淘選：將靶標分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫（噬菌體的數量可達1011PFU），利用抗原-抗體的特異性親和力將與抗體結合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結合的噬菌體洗脫下來，如此反復數輪擴增、淘選，即可將有用的基因從多達百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。

B.可用于模擬表位的篩選：利用噬菌體展示技術得到模擬表位的報道較多模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應，例如利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導產生高滴度的乙肝病毒抗體。

C.易于純化重組噬菌體的純化步驟簡單、不要求昂貴的試劑與設備，在一般的實驗室條件下就可以完成。缺點：首先，目前所建的肽庫容量只能達到109，要想構建大片段的肽庫很困難。其次，需要解決肽庫的多樣性問題。第三，少數多肽由于疏水性過強，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。噬菌體展示系統的應用及優(yōu)缺點當前第57頁\共有90頁\編于星期四\19點6、細胞內蛋白質共定位（cellularco-localization）——基于細胞內綠色蛋白示蹤技術的蛋白質間相互的研究方法當前第58頁\共有90頁\編于星期四\19點綠色熒光羅丹明染色重疊相差舉例細胞內蛋白質共定位研究兩種已知蛋白質時空表達關系當前第59頁\共有90頁\編于星期四\19點舉例當前第60頁\共有90頁\編于星期四\19點第三節(jié)

生物大分子相互作用分析新技術

當前第61頁\共有90頁\編于星期四\19點1、熒光共振能量轉移技術（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）——能夠對于細胞中的蛋白質間相互作用或對作用進行實時原位分析的檢測方法供體熒光素受體熒光素當前第62頁\共有90頁\編于星期四\19點FRET現象

Binding

NOBindingFRET:TheSize

當一個熒光分子(又稱為供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(又稱為受體分子)的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。FRET程度與供、受體分子的空間距離緊密相關，一般為7～10nm時即可發(fā)生FRET；隨著距離延長，FRET呈顯著減弱.當前第63頁\共有90頁\編于星期四\19點實驗設計InteractionXCFPYYFPUVlaserFRETYellowlightemissionYYFPXCFPUVlaserCyanlightemissionDonorAcceptor當前第64頁\共有90頁\編于星期四\19點FRET的能量供體和受體滿足條件：

供體受體的激發(fā)光譜要分得足夠開；供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊；供受體的發(fā)射光譜要足夠分開。當前第65頁\共有90頁\編于星期四\19點CFPYFPWavelength(nm)Normalizedintensity(%)GFP綠色熒光蛋白CFP(青色熒光蛋白)(第66位Tyr→Trp)(第203位Thr→Tyr)YFP(黃色熒光蛋白)CFP(λ433nm/λ476nm)YFP(λ513nm/λ527nm)FRET的能量供體和受體當前第66頁\共有90頁\編于星期四\19點

均相檢測（無分離和洗滌步驟）實時連續(xù)地觀察活細胞的動態(tài)變化FRET技術的優(yōu)勢FluorescenceIntensityTime

LigandCy3Cy5當前第67頁\共有90頁\編于星期四\19點ABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET應用的類型當前第68頁\共有90頁\編于星期四\19點當前第69頁\共有90頁\編于星期四\19點FRET應用范圍酵母雙雜交系統、噬菌體展示系統所篩選克隆的復證蛋白質—核酸相互作用酶活性分析 蛋白酶、磷酸激酶鈣流檢測、離子通道研究蛋白質的結構研究當前第70頁\共有90頁\編于星期四\19點FRET應用的局限性

信噪比經常不佳，通常為1：1

背景主要來自受體被直接激發(fā)的信號

檢測儀器的靈敏度、分辨率以及計算機影像采集和分析軟件的能力當前第71頁\共有90頁\編于星期四\19點2、表面等離子共振技術（surfaceplasmonresonance，SPR）——適合于多種類型分子并且無需借助標記物可以實現對復合物直接實時測定的方法

SPRimager?II

當前第72頁\共有90頁\編于星期四\19點

基本原理：基于表面等離子共振（SPR）技術來實時跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標記物。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面的分子結合、解離整個過程的變化。

當前第73頁\共有90頁\編于星期四\19點SPR現象SPRangle450?goldlayerp-Polarized

Light

表面等離子共振（SPR）是一種物理現象，當入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時，可引起金屬自由電子的共振，由于電子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內大大減弱。其中，使反射光在一定角度內完全消失的入射角稱為SPR角。SPR隨表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又和結合在金屬表面的生物分子質量成正比。因此可以通過獲取生物反應過程中SPR角的動態(tài)變化，得到生物分子之間相互作用的特異性信號。

當前第74頁\共有90頁\編于星期四\19點SPR角度——掃描曲線SPRangle當前第75頁\共有90頁\編于星期四\19點傳統檢測原理SPRangleshiftasbasisofmeasurement當前第76頁\共有90頁\編于星期四\19點SPRimaging

檢測原理Fixedangle,fixedwavelengthD%RReflectivitychangeasbasisofmeasurement當前第77頁\共有90頁\編于星期四\19點SPRimager系統RotatingStage流動相（含待分析物）Gold-coatedglassSPRchip?p-pollight棱鏡分子探針陣列當前第78頁\共有90頁\編于星期四\19點GWC’s“SPRImaging”

技術當前第79頁\共有90頁\編于星期四\19點BioarrayTerminologySPRchip?glassgoldattachmentchemistryBiosensorAnalyteProbe當前第80頁\共有90頁\編于星期四\19點MonitoringChanges:DifferenceImages=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbeArrayProbeArray+BiotinT7DifferenceImage:signalduetobindingofBiotinT7toStreptavidinABAB-當前第81頁\共有90頁\編于星期四\19點MonitoringChanges:Image+Chart當前第82頁\共有90頁\編于星期四\19點ValueofReal-TimeMonitoringProteinArray,

EndofExperimentAgSAConAddBiotinylatedAntibodyD%RminEnd-pointmeasurementsmissalltheaction當前第83頁\共有90頁\編于