真核生物基因表達調控演示文稿

真核生物基因表達調控演示文稿當前第1頁\共有64頁\編于星期四\9點（優(yōu)選）真核生物基因表達調控當前第2頁\共有64頁\編于星期四\9點本章主要內容基因表達與調控的基本概念與原理轉錄水平的調控(transcriptionalregulation):DNAlevel(Genetic)Chromatinlevel(Epigenetic)轉錄后水平的調控(post-transcriptionalregulation)：RNAinterference（RNAi）Proteindegradation（Ubiquitin/proteasome）當前第3頁\共有64頁\編于星期四\9點第一節(jié)

基本概念與原理BasicConceptsandPrinciples當前第4頁\共有64頁\編于星期四\9點Genome(cell’srepertoireofDNA)Transcriptome(cell’srepertoireofRNAtranscripts)Proteome(cell’srepertoireofproteins)單個基因單個細胞中心法則當前第5頁\共有64頁\編于星期四\9點一、基因表達的概念基因組(genome)一個細胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因?；虮磉_(geneexpression)基因經過轉錄、翻譯，產生具有特異生物學功能的蛋白質分子或RNA分子的過程?；虮磉_調控(generegulation,orregulationofgeneexpression)

基因表達是受內源及外源信號調控的。當前第6頁\共有64頁\編于星期四\9點RegulationofGeneExpressionChromatinepigeneticcontrolRNAsilencingProteindegradation一般而言的基因表達調控范疇當前第7頁\共有64頁\編于星期四\9點二、基因表達的時間性及空間性（一）時間特異性按功能需要，某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達的時間特異性(temporalspecificity)。多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性(stagespecificity)。當前第8頁\共有64頁\編于星期四\9點人體發(fā)育過程中不同類型β-珠蛋白的含量變化

當前第9頁\共有64頁\編于星期四\9點（二）空間特異性基因表達伴隨時間順序所表現出的這種分布差異，實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cellortissuespecificity)。在個體生長全過程，某種基因產物在個體按不同組織空間順序出現，稱之為基因表達的空間特異性(spatialspecificity)。當前第10頁\共有64頁\編于星期四\9點BARD1isexpressedspecificallyintheapicaldomainsof

Arabidopsisinflorescence(A),ovules(B),anthers

(C),andembryos(D).InsuithybridizationA,B,C,D:antisenseBARD1probe;E:senseBARD1probeasanegativecontrol.（朱玉賢第五章課件）當前第11頁\共有64頁\編于星期四\9點四種母源影響基因的mRNA和蛋白沿果蠅胚胎前-后軸分布的濃度變化圖

proteinBICOIDNANOS第十章（基因和發(fā)育）mRNA當前第12頁\共有64頁\編于星期四\9點FactsIdenticalgenome:VirtuallyeverycellinanorganismcontainsacompletesetofgenesSpatialspecificity:ButtheyarenotallturnedonineverycellortissueTemporalspecificity:EachcellofanorganismexpressesadistinctivesubsetofgenesatdifferenttimeordevelopmentalstageTight

regulation:Duringdevelopmentdifferentcellsexpressdifferentsetsofgenesinapreciselyregulatedfashion當前第13頁\共有64頁\編于星期四\9點三、基因表達的方式按對刺激的反應性，基因表達的方式分為：（一）組成性表達(constitutiveexpression)某些基因在一個個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因(housekeepinggene)。當前第14頁\共有64頁\編于星期四\9點這類基因表達又稱為組成性基因表達(constitutivegeneexpression)。genesforessentialcellularstructuresandmetabolicpathways(e.g.rRNA,actin,tubulin)usuallyexpressedathighleveltheleveloftheirgeneexpressionmayvaryHousekeepinggenesrRNA,actin,tubulin

arecommonlyusedasloadingcontrolinRT-PCRorNorthernblot當前第15頁\共有64頁\編于星期四\9點（二）誘導和阻遏表達在特定環(huán)境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表達產物增加，這種基因稱為可誘導基因(inducible

genes)。

如果基因對環(huán)境信號應答是被抑制，這種基因是可阻遏基因(repressiblegenes)?；虮磉_調控大多數是對這些基因的轉錄和翻譯速率的調節(jié),從而導致其編碼產物的水平發(fā)生改變，影響其功能。當前第16頁\共有64頁\編于星期四\9點四、基因表達調控的生物學意義（一）維持細胞增殖、分化（二）維持個體生長、發(fā)育（三）適應環(huán)境變化第九、十章（基因與疾病、基因與發(fā)育）將要講到當前第17頁\共有64頁\編于星期四\9點1.Transcripts（轉錄本）beginandendbeyondthecodingregion(5’UTRand3’UTR)2.Theprimarytranscriptisprocessedby: 5’capping 3’formation/polyA

splicing3.Maturetranscriptsaretransportedtothecytoplasmfortranslation一般而言，基因表達調控主要是發(fā)生在基因轉錄水平上的調節(jié)，即：mRNA合成的多少。transcription當前第18頁\共有64頁\編于星期四\9點五、基因轉錄調節(jié)基本要素（一）RNA聚合酶(RNAPolymerase)（二）特異DNA序列(cis-actingelements)（三）調節(jié)蛋白(trans-actingfactors)GeneexpressionregulationatthelevelofDNA

(transcriptionalregulation) --highlysequence-dependent --variedregulationfordifferentgenes當前第19頁\共有64頁\編于星期四\9點cis-actingelements:promoters/regulatorysequencesofgenestrans-actingfactors:proteinsandRNAsthatbindcis-elementsandpromoteorrepressgeneexpression當前第20頁\共有64頁\編于星期四\9點

(一)RNA聚合酶啟動子、調節(jié)序列和調節(jié)蛋白通過DNA-蛋白質相互作用、蛋白質-蛋白質相互作用影響RNA聚合酶活性。RNA

Pol

I:

rRNA,相對活性50-70%RNA

Pol

II:

mRNA,相對活性20-40%RNAPolIII:tRNA,相對活性10%RNAPolIV:smallncRNA,相對活性??當前第21頁\共有64頁\編于星期四\9點真核生物基因組中含有可以調控自身基因表達活性的特異DNA序列，稱為順式作用元件(cis-actingelement)。

順式作用元件能夠被轉錄調節(jié)蛋白特異識別和結合，從而影響基因表達活性。啟動子(promoter)

順式作用元件又分增強子(enhancer)沉默子(silencer)En/SiProDNA編碼序列轉錄起始點

（二）特異DNA序列當前第22頁\共有64頁\編于星期四\9點反式作用因子(trans-actingfactor)

能直接或間接與順式作用元件相互作用，進而調控基因轉錄的一類調節(jié)蛋白，統(tǒng)稱為反式作用因子。按其功能不同，常有以下三類：

基本轉錄因子:識別promoter元件轉錄調節(jié)因子:識別enhancer或silencer共調節(jié)因子：不能進行DNA-蛋白質相互作用（三）真核基因的調節(jié)調節(jié)蛋白當前第23頁\共有64頁\編于星期四\9點RNA聚合酶Ⅱ在轉錄因子幫助下，形成的轉錄起始復合物polⅡTFⅡHTAFTFⅡFTAFTAFTFⅡATFⅡBTBPTATADNATAF:TBP

associatedfactorsholoenzyme1.基本轉錄因子(generaltranscriptionfactor,GTF)

是指能夠直接或間接與啟動子核心序列TATA盒特異結合、并啟動轉錄的一類調節(jié)蛋白。TBP:TATA-boxbindingproteinTFII:polIIassociatedTF當前第24頁\共有64頁\編于星期四\9點2.轉錄調節(jié)因子(transcriptionfactor,TF)

這類調節(jié)蛋白能識別并結合轉錄起始點的上游序列和遠端的增強子元件，通過DNA－蛋白質相互作用而調節(jié)轉錄活性。決定不同基因的時間、空間特異性表達.

轉錄激活因子(transcriptionalactivator)

轉錄阻遏因子(transcriptionalrepressor)3.共調節(jié)因子(transcriptionalregulator/co-factor)首先與轉錄因子發(fā)生蛋白－蛋白相互作用，進而影響它們的分子構象，以調節(jié)轉錄活性,本身無DNA結合活性。如果與轉錄激活因子有協同作用——共激活因子；與轉錄阻遏因子有協同作用——共阻遏因子。當前第25頁\共有64頁\編于星期四\9點常見轉錄因子的結構域(domain)DNA結合域（DNA

binding

domain)BasicAA(K/R)rich,positivelycharged轉錄激活域(trans-activationdomain)TF蛋白質-蛋白質結合域（dimerization,co-factors）

谷氨酰胺(Q)富含域酸性激活域(D/E-rich)脯氨酸(P)富含域當前第26頁\共有64頁\編于星期四\9點ZincFingerbHLHbZIPHomeodomain1）TF最常見的DNA

bindingdomain當前第27頁\共有64頁\編于星期四\9點(1)鋅指(zincfinger)常結合GC

boxCys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-HisC-terminal:α-helixbindingDNA當前第28頁\共有64頁\編于星期四\9點(2)堿性亮氨酸拉鏈bZIP當前第29頁\共有64頁\編于星期四\9點bHLH蛋白(basicHelix-Loop-Helix)(3)堿性螺旋-環(huán)-螺旋bHLH當前第30頁\共有64頁\編于星期四\9點2）TF常見的trans-activationdomain當前第31頁\共有64頁\編于星期四\9點(Activationdomainisinterchangeable)當前第32頁\共有64頁\編于星期四\9點InteractionAssaysDesignofTwo-hybrid/Three-hybrid/etc…separablefunctionaldomainsTwo-hybridassay(protein-protein)Tri-hybridassay(protein-RNA)當前第33頁\共有64頁\編于星期四\9點

1.

RNA

polymerase

II

2.

promoter

and

enhancers

3.

transcription

factorsEukaryoticgeneexpressionisusuallycontrolledatthelevelofinitiationof

transcription.真核基因轉錄起始的調控當前第34頁\共有64頁\編于星期四\9點

Holoenzyme---asupramolecularcomplexcomprisingPolII, mostGTFs,andMediator/SrbcomplexInyeast,a2MDaholoenzyme+TBPsufficesfortranscriptionOrderedAssemblyandPolIIHoloenzymeTFIIDTFIIDone-stepmultiple-step當前第35頁\共有64頁\編于星期四\9點TFIIBbindstoDNAandcontactsRNA

polymeraseneartheRNAexitsiteandattheactivecenter,and

orientsitonDNA.+25bpQ:prok-10bpvseuk-25bp?SequentialAssemblyTBP:TATAbindingproteinTAFs:TBPassociatedfactorsBindingofTFIID(TBP+11TAFs,800KD)totheTATAboxisthefirststepininitiation.當前第36頁\共有64頁\編于星期四\9點CTD：RNAPolIIC-terminaldomainCTDisanunusualextensionappendedtotheCterminusofthelargestsubunitofRNApolymeraseII.Itcomprisesfrom25to52tandemcopiesoftheconsensusrepeatheptadY1S2P3T4S5P6S7.S2andS5aremajorphosphorylationsites.CTDphosphorylationcausetheconversionofprolineisomerizationstates.PhosphorylationpatternsontheCTDrepeatsdeterminedifferentsetsofassociatedfactors,sothatprovideadynamicplatformtorecruitdifferentregulatorsofthetranscriptionapparatus.Ineukaryoticcells,thetranscriptionofgenesisaccuratelyorchestratedbothspatiallyandtemporallybytheC-terminaldomainofRNApolymeraseII(CTD).當前第37頁\共有64頁\編于星期四\9點PIC:PhosphoS5isrequiredforassemblyofthePICandfacilitatesmRNAcappingviarecruitmentofcappingenzymes.Elongation:S5graduallybecomesdephosphorylated,whereasS2isphosphorylated.Terminating:PhosphoS2ensuresefficient3′-RNAprocessingbytriggeringrecruitmentof3′-RNAprocessingmachinery.Ending:CTDsarefreeofphosphategroups;non-phosphorylatedCTDsarerequiredforRNApolymeraseIItorecycleandbindapromoterforthenextcycleoftranscription.S2&S5,thetriggerfortranscriptionalprocessmodulation當前第38頁\共有64頁\編于星期四\9點當前第39頁\共有64頁\編于星期四\9點FactorsinvolvedingeneexpressionincludeRNA

polymeraseandthebasalapparatus,activatorsthatbinddirectly

to,co-activatorsthatbind

tobothactivatorsandthebasalapparatus,andregulatorsthat

actonchromatinstructure(chromatinremodelingcomplex).ManyTranscriptionalActivatorsi.e.CAATGC-box當前第40頁\共有64頁\編于星期四\9點NeartheinitiationsiteAlittlefaraway當前第41頁\共有64頁\編于星期四\9點SP1stimulatestranscriptioninpresenceofTAFII110GCboxesboundbyDNAbindingproteinSP1SP1recruitsTFIIDbybindingTAFII110Partiallyreconstitutedcomplex(TBPand3TAFs)inadditionto otherGTFs,PolIIleadstohighlevelsoftranscription

SV40earlypromoterNear當前第42頁\共有64頁\編于星期四\9點MediatorcomplexistargetedbyanactivatorMediatorisastablecomplexcontainingseveralproteins(20-50)MediatorbindstotheRNApolIIandtranscriptionfactors(activators orrepressors)and‘mediates’theregulatorysignalstopolII

(中介復合體）Far當前第43頁\共有64頁\編于星期四\9點Whatisthemechanismofactivation?Twomodels:

Tetheringholoenzyme

(recruitment)Activatingholoenzyme(allosteric)(interactionactivation)??當前第44頁\共有64頁\編于星期四\9點Infavorofrecruitment

model（勾引模型）當前第45頁\共有64頁\編于星期四\9點tatproteinofHIVcanstimulate

transcriptioninitiationwithoutbindingDNAatall

TheactivatingdomainofthetatproteincanstimulatetranscriptionifitistetheredinthevicinityofpromoterbybindingtotheRNAproduct(tarsequence)ofapreviousroundoftranscription.tartat當前第46頁\共有64頁\編于星期四\9點DNA-bindingdomainistobringtheactivationdomainintothevicinityofthestartpoint.

Andactivationisindependentofthemeansoftethering.wecanthinkofDNA-binding(orRNA-bindinginthecaseoftat)domainasprovidinga"tethering"function,whosemainpurposeistoensurethattheactivationdomainisinthevicinityoftheinitiationcomplex.Thenotionoftetheringisamoregeneralideathatinitiationrequiresahighconcentrationoftranscriptionfactorsinthevicinityofthepromoter.Thismaybeachievedwhenactivatorsbindtoenhancers,upstreampromoterelements,orinanextremecasebytetheringtoanewly-madeRNAproduct.當前第47頁\共有64頁\編于星期四\9點總結

所有激活因子的共性：識別靶位點（啟動子、增強子）的特異性由DNA結合域決定。DNA結合域將轉錄激活域帶到基礎轉錄區(qū)域附近。

直接作用的激活因子具有DNA結合域和轉錄激活域。

沒有轉錄激活域的激活因子可能與具有轉錄激活域的共激活因子一起行使功能。

基礎轉錄區(qū)域中許多元件是（共）激活因子的靶位點RNA聚合酶可以和多種不同的轉錄因子相互作用，形成全酶復合物行使功能。當前第48頁\共有64頁\編于星期四\9點‘Synergy’

HighlevelsoftranscriptioninducedbymultiplefactorsTranscriptionfactorscanenhancetranscriptioninanon-linearmannerSynergisiticactivationoccursduetomultiplecontactswiththemachineryMultiplecopiesofthesameactivatoralsoinducesynergisticactivation當前第49頁\共有64頁\編于星期四\9點Interferon?enhancerEnhancersoftenhavebindingsitesforseveraltranscription

factorsTranscriptionfactorscanbind

cooperativelyatadjacentsitesArchitecturalfactors(withnoregulatorydomains,i.e.HMG1)canassistassemblyRemarkablyincreasebindingaffinityforbothDNAandmachinery當前第50頁\共有64頁\編于星期四\9點HMG1肩并肩、手挽手，根基穩(wěn)、魅力足香肩并立、玉指緊扣，腳如磐石、面若桃花當前第51頁\共有64頁\編于星期四\9點Onepossiblestrategy:----Looping----Cohesinshelptostabilizeenhancer-promoterinteractionsHowdoenhancersactindependentofdistanceandorientation?當前第52頁\共有64頁\編于星期四\9點Anenhancermayfunctionbybringingproteinsintothevicinityof

thepromoter.Anenhancerdoesnotactonapromoterattheoppositeendofalong

linearDNA,butbecomeseffectivewhentheDNAisjoinedintoacirclebyaprotein

bridge.An

enhancerandpromoteronseparatecircularDNAsdonotinteract,butcan

interactwhenthetwomoleculesarecatenated.Twoexperimentssupporttheloopingmodel--Theessentialroleoftheenhanceris

toincreasetheconcentrationofactivatorin

thevicinityofthepromoter---當前第53頁\共有64頁\編于星期四\9點Receptorsformanysteroidandthyroid

hormoneshaveasimilarorganization,withanindividualN-terminalregion,conservedDNA-bindingregion,anda

C-terminalhormone-bindingregionSteroidreceptorsaretranscriptionfactorsZinc

finger

TF當前第54頁\共有64頁\編于星期四\9點Glucocorticoidsregulategenetranscriptionbycausingtheir

receptortotransportintothenucleusandbindtoanenhancerwhoseactionis

neededforpromoterfunction.ActivationofGlucocorticoidReceptor(GR)Nuclearshuttling當前第55頁\共有64頁\編于星期四\9點利用GR的特性構建可誘導表達融合蛋白系統(tǒng)DexamethasoneGRGRGRXXXDexamethasone（DEX）:地塞米松,氟美松(抗炎藥)，合成的一種糖皮質激素；通過分子克隆的方法將GR和要研究的核蛋白X構建成融合蛋白，轉基因到酵母、動物細胞或者植物中；不施加外源DEX時，融合蛋白與HSP90形成復合物，由于構象和空間位阻等原因，融合蛋白存在于胞質中，不能定位到細胞核；添加DEX時，DEX擴散入胞與GR相結合，融合蛋白改變構象后核定位信號暴露，即可入核行使功能；用以研究核蛋白的功能（包括轉錄因子）。當前第56頁\共有64頁\編于星期四\9點ActivationTaggingapproach

inplantsPlanttransformationmutantsscreeninglocateT-DNAinsertionsiteinArabidopsisgenome(how?)identifytherightgeneconferringmutantphenotype(how?)構建T-DNA序列，其中包括4倍重復的CaMV的35S增強字序列，4×35S元件可以大大增強相鄰基因的轉錄；通過轉基因的方法將T-DNA片段整合到植物基因組中；植物基因組上與T-DNA插入位點相近的基因表達量增高，即得到這個基因gain-of-function的轉基因植物；當前第57頁\共有64頁\編于星期四\9點XVE＝LexA的DNA結合域(X)＋VP16轉錄激活域(V)＋humanestrogenreceptor調控域(E)NPTII；轉基因篩選標記OLexA-46：LexA操縱子＋CaMV35S基本啟動子（而非增強子）

Achemical-inducibleactivationtaggingvectorpER16inpl