Ion-Torrent基因測(cè)序儀-課件

SemiconductorSequencingforLife?IonTorrent離子半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)為醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究帶來新的機(jī)遇新一代半導(dǎo)體高通量Ion測(cè)序平臺(tái)介紹Ion

torrent平臺(tái)在醫(yī)學(xué)及臨床診斷領(lǐng)域應(yīng)用

1）腫瘤

2）婦嬰生育保健領(lǐng)域

3）HLA分型

4）病院微生物領(lǐng)域IonTorrent部分用戶名單內(nèi)容新一代半導(dǎo)體高通量Ion測(cè)序平臺(tái)介紹3IonSemiconductorSequencing:

Scalability,Simplicity,Speed,BenchtopSequencingforAllPGM?forGenes.Proton?forGenomes.SequencingforAll.2011Q12012Q3Ion

PGMTM

SequencerIon

ProtonTM

SequencerIon測(cè)序技術(shù)平臺(tái)

——FirstPostLight?sequencingtechnology

Founded2007byJonathanRothbergPioneerednextgenesequencingFounded454,CuraGen,RaindancePartofLifeTechnologieswithofficesinConnecticut,Massachusetts,andCaliforniaGlobalmanufacturingsitesAnnouncein2010AGBTLaunchedDecember2010快速完成檢測(cè)PGMChips:314Chip:1.2Mwells316Chip:6.1Mwells318Chip:11MwellsRothbergJ.M.etalNaturedoi:10.1038/nature10242SensorPlateSiliconSubstrateDrainSourceBulkdNTP?pH?Q?VSensingLayerH+4種dNTP依次流過Ion芯片DNA聚合反應(yīng)產(chǎn)生的氫離子的直接檢測(cè)每個(gè)堿基的檢測(cè)只需要幾秒擴(kuò)展性高

CMOS(互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體)技術(shù)40年的摩爾定律簡(jiǎn)單天然dNTP無激光光源非光學(xué)檢測(cè)無拍照系統(tǒng)非熒光檢測(cè)非酶級(jí)聯(lián)放大檢測(cè)速度快快速完成測(cè)序反應(yīng)芯片就是測(cè)序儀IonPI?ChipIonPI?Chip用來完成外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

IonPII?Chip完成全基因組測(cè)序165MwellsUpto10Gb60-80M

FilteredReads1-2Exomes1-4Transcriptomes660MwellsUpto20Xhumangenome240-320M

FilteredReads4-8Exomes4-16TranscriptomesIonPII?ChipThecontentprovidedhereinmayrelatetoproductsthathavenotbeenofficiallyreleasedandissubjecttochangewithoutnoticeSmallGenomeTranscriptome100M1G10GSequenceOutputperRun100GExomeSmalltoLargeGenePanels10MUnprecedentedScalability

10,000-FoldFromIon314?toIonPIII?ChipIon316?Ion314Ion318?IonPII?Human

GenomeIonPI?IonPIII?From1.2MillionSensors…to1.2BillionSensorsThecontentprovidedhereinmayrelatetoproductsthathavenotbeenofficiallyreleasedandissubjecttochangewithoutnoticeIon技術(shù)平臺(tái)在各研究領(lǐng)域應(yīng)用10ppt課件病源微生物領(lǐng)域：

細(xì)菌、病毒等denovo全基因組測(cè)序菌群宏基因組測(cè)序（16SrRNA）耐藥菌株篩選婦嬰生育保健領(lǐng)域：新生兒遺傳病篩查無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胚胎移植前染色體/遺傳病檢測(cè)（試管嬰兒）線粒體DNA突變篩查腫瘤領(lǐng)域：早期診斷、個(gè)性化治療、預(yù)后監(jiān)督Ion測(cè)序平臺(tái)應(yīng)用于臨床診斷及醫(yī)學(xué)研究HLA分型：器官移植、個(gè)性化藥物治療1.IonAmpliseq技術(shù)應(yīng)用于腫瘤診斷及個(gè)性化治療IonAmpliseq技術(shù)多重PCR靶向捕獲技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行幾千重甚至上萬重PCR

起始DNA量最低僅需10ng，適合FFPE標(biāo)本及其他微量標(biāo)本適合降解樣本，采用150bp引物擴(kuò)增設(shè)計(jì)Readsontarget效率高（96%以上），覆蓋均一性好+ConstructLibraryPrepareTemplateRunSequenceAnalyzeDataIonAmpliseqPanels----固定或定制試劑盒

DNA----基因突變篩查：

CancerHotspotPanelv2:50個(gè)腫瘤相關(guān)基因，207個(gè)擴(kuò)增子

ComprehensiveCancerPanel:409個(gè)腫瘤相關(guān)基因，16000個(gè)擴(kuò)增子

IonAmpliseq

Exome：全外顯子組CustomPanels：定制客戶感興趣的腫瘤基因

CommunityPanels：結(jié)腸癌/肺癌、乳腺癌/卵巢癌，白血病，心血管病等RNA----基因表達(dá)量篩查：RNACancerPanel：50個(gè)腫瘤相關(guān)基因RNAApoptosisPanel：267個(gè)凋亡相關(guān)基因

CustomRNAPanels：定制客戶感興趣的腫瘤基因（1）腫瘤熱點(diǎn)突變?cè)噭┖校篒onAmpliSeq?CancerHotspotPanelv250個(gè)腫瘤基因，207擴(kuò)增子，2855個(gè)熱點(diǎn)突變（COSMIC數(shù)據(jù)庫）,一天完成檢測(cè)KRASBRAFEGFRTP53PIK3CACSF1RJAK2NRASPTPN11ERBB2SRCFGFR3NPM1CDKN2ARETHNF1ASMAD4GNASPDGFRAMPLABL1PTENFLT3STK11SMARCB1KITMETNOTCH1FGFR2RB1JAK3VHLKDRSMOEZH2HRASAKT1ALKMLH1FBXW7ERBB4GNA11,GNAQATMCDH1IDH1CTNNB1APCFGFR1IDH2晚期直腸癌患者的石蠟切片樣本，在配套服務(wù)器上分析時(shí)間約10分鐘

PGM檢測(cè)到的突變，經(jīng)毛細(xì)管電泳測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果一致黃色標(biāo)注的是在COSMICDatabase里找到的和腫瘤相關(guān)的突變信息：KRAS：直腸癌常見突變，如果患者發(fā)生此突變一般需要進(jìn)行放射性化療，單抗藥物治療效果不佳；

TP53：此突變預(yù)示該患者的預(yù)后效果會(huì)較差；APC：此高頻突變常出現(xiàn)在晚期癌癥患者，具有診斷意義。金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心利用CancerHotspotPanel進(jìn)行腫瘤基因突變篩查（2）綜合腫瘤試劑盒：IonAmpliSeq?ComprehensiveCancerPanel*Preliminarygenelistavailable/community

Detectionofsomaticvariantsto~10%allelefrequencyUsewithIon318?Chip409個(gè)腫瘤基因,~16,000擴(kuò)增子，一張318芯片檢測(cè)一個(gè)標(biāo)本（3）針對(duì)客戶感興趣基因定制Ampliseq試劑盒：IonAmpliSeq?CustomPanels

適用于包括腫瘤等各種疾病研究及診斷ChipType

Genome

Coverage500X(Somatic)20X(Germline)Ion314?1kb10kbIon316?50kb100kbIon318?500kb1,000kbEnteryourcustomtargetregionsupto1Mbatwithmajorityofdesignscompletedinaslittleas2.5hoursUpto6,144ampliconsperpool,withthespecificityanduniformityofPCRDNAtoannotatedvariantcallsinaslittleas10hoursTotal#ofamplicons/poolOligosperpool48–6,14496-12,288（4）合作開發(fā)腫瘤試劑盒：IonAmpliSeq?CommunityPanels與頂尖的研究人員共同設(shè)計(jì)IonAmpliSeq?Exome~294,000primerpairsacross12primerpools>24,500-plexPCR!~2.4MPCRsperplateof8exomes!!TotalDNAinputaslowas50ngCovers>97%ofCCDS(Release12)>19,000codinggenes,>198,000codingexons,noUTRs,miRNAs,orncRNAs~85%ofhumandisease-causingvariantsfoundincodingregionsorsplicejunctions1Ampliconsizerange225-275bpAverageinsertsizeis~202bpIonAmpliSeq?ExomeKitsincludeIonPI?Chipsv2二、Ion測(cè)序平臺(tái)在婦嬰生育保健領(lǐng)域中的應(yīng)用育齡夫婦遺傳病攜帶信息篩查新生兒遺傳病篩查新生兒疑難雜癥研究線粒體DNA突變篩查

無創(chuàng)產(chǎn)前診斷染色體異倍性胚胎移植前染色體異倍性檢測(cè)胚胎移植前單基因遺傳病檢測(cè)

應(yīng)用1----無創(chuàng)產(chǎn)前診斷無創(chuàng)產(chǎn)前診斷—檢測(cè)母親血漿游離胎兒DNA

華大基因37臺(tái)Proton，愛建生物32臺(tái)Proton實(shí)驗(yàn)流程需要時(shí)間母體血漿游離DNA抽提1h文庫構(gòu)建（lowinputmethod)4hePCR

（OneTouchKit）4hOT+15min手動(dòng)PGMsequencing1.5-2.5h數(shù)據(jù)分析0.5-1hIonTorrent使用芯片每張芯片支持樣本數(shù)PGM318

chip1-2個(gè)ProtonPIchip10-20個(gè)PIIchip50-100個(gè)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)流程華大利用PGM測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)篩發(fā)表的SCI論文正常T13T18T2113例血漿標(biāo)本：4例正常、6例T21、2例T18、1例T13

每張318芯片檢測(cè)一個(gè)標(biāo)本，24小時(shí)完成實(shí)驗(yàn)

染色體異倍體檢測(cè)準(zhǔn)確性100%

ProtonI可同時(shí)檢測(cè)16個(gè)標(biāo)本Trisomy13Trisomy18試管嬰兒胚胎植入前單細(xì)胞檢測(cè)染色體多倍性單細(xì)胞擴(kuò)增基因組DNA，利用PGM測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)染色體多倍性只需要約0.5Mreads即可分析染色體多倍性316芯片可同時(shí)檢測(cè)6-8個(gè)樣本，318芯片可同時(shí)檢測(cè)12-15個(gè)標(biāo)本1-2天可出檢測(cè)報(bào)告應(yīng)用2----胚胎移植前染色體多倍性檢測(cè)應(yīng)用3----胚胎移植前單基因遺傳病檢測(cè)Evaluationoftargetednext-generationsequencing–basedpreimplantationgeneticdiagnosisof

monogenicdisease.FertilityandSterility.2012本文中作者對(duì)PGM平臺(tái)用于PGD單基因病檢測(cè)進(jìn)行評(píng)估

選了6對(duì)有遺傳病的夫婦，其后代得病風(fēng)險(xiǎn)高

樣本為體外受精后囊胚的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞

針對(duì)遺傳病相關(guān)的突變位點(diǎn)及indels，分別用PGM測(cè)序法及傳統(tǒng)的qPCR法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果100%一致

使用PGM平臺(tái)進(jìn)行PGD單基因病檢測(cè)，準(zhǔn)確性高、速度快、成本低檢測(cè)方法----IonAmpliSeq?技術(shù)：靶向捕獲遺傳病相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)序+應(yīng)用4----育齡夫婦遺傳病攜帶信息篩查ConstructLibraryPrepareTemplateRunSequenceAnalyzeData多重PCR靶向捕獲技術(shù)，最多在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行6144重PCR

起始DNA量?jī)H需10ng，適合各種微量標(biāo)本Readsontarget效率高，覆蓋均一性好（相比探針雜交靶向捕獲技術(shù)）中國患有遺傳疾病的人群達(dá)幾千萬，攜帶遺傳病相關(guān)基因的人數(shù)就更多。這些基因很可能遺傳給下一代，因此非常有必要對(duì)育齡夫婦進(jìn)行遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)！IonAmpliSeq?遺傳病檢測(cè)試劑盒

328個(gè)基因,10,000擴(kuò)增子,>700種遺傳病

（OMIM數(shù)據(jù)庫）,一天內(nèi)完成檢測(cè)利用IonAmpliSeq?技術(shù)靶向捕獲新生兒遺傳病相關(guān)基因

使患病的新生兒得以早期診斷、早期治療GeneDiseaseAmpliconsregionPAHPhenylketonuria(PKU)151359bpCOL11A2InheritedDeafness735470bpGJB2InheritedDeafness5681bpGJB3InheritedDeafness6813bpGJB6InheritedDeafness6786bpKCNQ4InheritedDeafness242088bpSLC26A4SyndromicDeafness302246bp應(yīng)用5----新生兒遺傳病篩查苯丙酮尿癥、先天性耳聾相關(guān)基因紐約州衛(wèi)生署利用PGM測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行新生兒篩查發(fā)表的SCI論文

研發(fā)出一套CASM方法，可以從新生兒干血斑中提取基因組DNA

通過PCR靶向獲取遺傳病相關(guān)基因：GALC（Krabbe癥，腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥）PAH（苯丙酮尿癥）GALT（半乳糖血癥）ACADM（中鏈脂肪酸去氫酵素缺乏癥）ACADVL（極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥）

利用IonPGM測(cè)序儀及一代Sanger法測(cè)序儀對(duì)5個(gè)遺傳病基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果一致性>99%(6)利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)研究疑難雜癥

美國一位叫HarrisonHarkins的嬰兒，出生9個(gè)月之后出現(xiàn)了奇特的癥狀：

獨(dú)特的面部特征、身體偏小、進(jìn)食困難、發(fā)育停滯、智力缺陷等。

貝勒醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家對(duì)這種未知的罕見疾病利用全外顯子組測(cè)序的方法，找到了一個(gè)功能未知基因ASXL3發(fā)生了突變，并且嬰兒的雙親都沒有這種突變。

為了進(jìn)一步證實(shí)突變與疾病的相關(guān)性，科學(xué)家們?cè)谌蛘业搅?名類似癥狀的小孩，都有這種突變。

利用ASXL3突變信息可以用于診斷新生兒剛出生時(shí)是否患有這種罕見疾病，盡早采取治療措施。

全外顯子組測(cè)序技術(shù)非常適合于尋找疑難雜癥的分子病因。Mitochondrialgenesofdeafness：A1555GDeepsequenceforheteroplasmydetection

(>1000xcoverageonIon314)Abilitytodo16samplesperrunwithbarcodingAccuratevariantcalling,especiallyinhypervariableregionsofmitochondriaHumanMitochondrialSequencingMutationdetectedonposition15450Prof/.StefanSchusterPenn.StateUniversityRapidresequencingofmitochondrialgenomesfordiseaseresearch,biodiversityassessment線粒體疾病----13個(gè)編碼多肽的基因編碼產(chǎn)物基因分析基因變異對(duì)應(yīng)的常見線粒體病種類NADHdehydrogenase(complexI)MT-ND1Leber遺傳性視神經(jīng)病MT-ND2心肌線粒體病，Leber遺傳性視神經(jīng)病MT-ND3進(jìn)肌陣攣，癲癇，視神經(jīng)萎縮MT-ND4Leber遺傳性視神經(jīng)病，線粒體肌病，Leber遺傳性視神經(jīng)病，張力障礙MT-ND4LLeber遺傳性視神經(jīng)病MT-ND5Leigh綜合征，線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥MT-ND6Leber遺傳性視神經(jīng)病，線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥，糖尿病，肌張力障礙coenzymeQ-cytochromecreductase/Cytochromeb(complexIII)MT-Cytb慢性游走性紅斑，Leber遺傳性視神經(jīng)病，線粒體肌病，心肌線粒體病，線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥，帕金森病cytochromecoxidase(complexIV)MT-COX1肌紅蛋白尿運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，鐵粒幼細(xì)胞貧血MT-COX2線粒體肌病，線粒體多系統(tǒng)疾病，線粒體腦肌病MT-COX3Leigh綜合征，慢性游走性紅斑，骨骼肌溶解癥ATPsynthaseMT-ATP6共濟(jì)失調(diào)并發(fā)色素性視網(wǎng)膜炎，母系遺傳Leigh綜合征，家族性雙側(cè)紋狀體壞死MT-ATP8共濟(jì)失調(diào)并發(fā)色素性視網(wǎng)膜炎，母系遺傳Leigh綜合征，家族性雙側(cè)紋狀體壞死

線粒體疾病----22個(gè)編碼tRNA的基因AlanineMT-TA進(jìn)行性眼外肌麻痹ArginineMT-TRAsparagineMT-TN線粒體肌病，進(jìn)行性眼外肌麻痹AsparticacidMT-TD心肌線粒體病，肌陣攣CysteineMT-TC慢性游走性紅斑GlutamicacidMT-TE心肌線粒體病，慢性游走性紅斑GlutamineMT-TQ線粒體肌病，線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥GlycineMT-TG心肌線粒體，嬰兒猝死綜合征，慢性游走性紅斑HistidineMT-THIsoleucineMT-TI線粒體肌病，心肌線粒體病，進(jìn)行性眼外肌麻痹LeucineMT-TL1慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹，Leer遺傳性視神經(jīng)病，線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥，線粒體肌病，心肌線粒體病，糖尿病和線粒體耳聾MT-TL2心肌線粒體病，慢性游走性紅斑，慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹，線粒體肌病，鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血LysineMT-TK心肌線粒體病，慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹，肌陣攣性癲癇發(fā)作伴破碎紅纖維，線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥，線粒體耳聾MethionineMT-TM線粒體肌病，淋巴瘤PhenylalanineMT-TF線粒體腦肌病、乳酸中毒以及卒中樣發(fā)作，骨骼肌溶解癥ProlineMT-TP線粒體肌病，進(jìn)行性眼外肌麻痹SerineMT-TS1掌跖角化癥，線粒體耳聾，肌陣攣性癲癇發(fā)作伴破碎紅纖維-線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥MT-TS2糖尿病和線粒體耳聾ThreonineMT-TT心肌線粒體病，慢性游走性紅斑TryptophanMT-TWLeigh綜合征，共濟(jì)失調(diào)舞蹈病，線粒體肌病TyrosineMT-TY慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹ValineMT-TVLeigh綜合征，線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥，線粒體多系統(tǒng)疾病12SribosomalRNAMT-RNR1帕金森病，氨基糖甙類抗生素致聾16SribosomalRNAMT-RNR2心肌線粒體病8long-rangePCR:enhancer-promoterto3’UTRRoche454Junior平臺(tái)：10個(gè)標(biāo)本，每次運(yùn)行檢測(cè)一個(gè)標(biāo)本，成本約$1500persample。每個(gè)標(biāo)本平均100Kreads，41Mb堿基，14.5Mb有效匹配堿基，387.9X測(cè)序深度IonTorrent平臺(tái)：一張316芯片同時(shí)檢測(cè)4個(gè)標(biāo)本，成本約$70perlocuspersample。每個(gè)標(biāo)本平均650Kreads，130Mb堿基，45Mb有效匹配堿基。所以一張316芯片可同時(shí)檢測(cè)更多的標(biāo)本，成本更低。若用318芯片，可同時(shí)檢測(cè)32個(gè)標(biāo)本，成本可低于$17perlocuspersample。三、Ion測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于HLA分型微生物全基因組denovo測(cè)序菌群宏基因組測(cè)序（16SrRNA）病毒分型耐藥菌株篩選四、Ion測(cè)序技術(shù)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用病源微生物領(lǐng)域1----細(xì)菌全基因組測(cè)序大腸桿菌：德國毒黃瓜炭疽桿菌葡萄球菌：韓國豆瓣醬腦膜炎雙球菌阿爾萊特葡萄球菌,來源于心血管病人葡萄球菌：引起自體瓣膜心內(nèi)膜炎PGM初登場(chǎng)，3天破譯腸道致病菌第一天5月30日文庫制備0104:H4和HUSC41樣品（對(duì)照）菌株文庫制備第二天5月31日完成第一輪測(cè)序0104:H4擴(kuò)增和測(cè)序，2×2測(cè)序（Ion314芯片）第三天