轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器

轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器第一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

隨著DNA內(nèi)部結(jié)構(gòu)和遺傳機(jī)制的揭示，生物學(xué)家不再僅僅滿足于探索、揭示生物遺傳的秘密，而是設(shè)想在分子水平上去改造生物的遺傳特性。9.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)第二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

如果將一種生物DNA中的某個遺傳密碼片段連接到另外一種生物的DNA鏈上去，將DNA重新組織一下，就可以按照人類的愿望設(shè)計出新的遺傳物質(zhì)，從而創(chuàng)造出新的生物。

這種按照人的意愿，由重新組裝基因到新生物產(chǎn)生的生物技術(shù)，就稱為基因工程技術(shù)。第三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

基因工程技術(shù)的特點：

基因體外重組、即在離體條件下對DNA分子切割并將其與載體DNA分子連接，得到重組DNA。世界上第一批重組DNA分子誕生于1972年，次年幾種不同來源的DNA分子裝入載體后被轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中表達(dá)，標(biāo)志著基因工程正式登上歷史舞臺。第四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

發(fā)展：1、外來基因能在生物體內(nèi)表達(dá)

1974年，美國斯坦福大學(xué)教授科恩把金黃色葡萄球菌的抗藥性基因片段和大腸桿菌的質(zhì)粒“組裝”成雜合質(zhì)粒，送入大腸桿菌體內(nèi)，使這種大腸桿菌獲得了對青霉素的抗藥性。這說明金黃色菌萄球菌質(zhì)粒上的抗青霉素基因由雜合質(zhì)粒帶到大腸桿菌體內(nèi)，更重要的是表明外來基因在大腸桿菌體內(nèi)同樣也發(fā)生作用。第五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一2、基因工程完全可以不受生物種類的限制，而按照人類的意愿去拼接基因，創(chuàng)造新的生物。

1974年，科恩又將非洲爪蟾的DNA與大腸桿菌的質(zhì)粒“拼接”，獲得成功，拼接后的雜合質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌，產(chǎn)生了非洲爪蟾的核糖體核糠核酸(rRNA)；兩棲動物的基因能在細(xì)菌里發(fā)揮作用．科恩隨后以DNA重組技術(shù)發(fā)明人的身份向英國專利局申報專利、因此成為世界上第一個基因工程的技術(shù)專利擁有人。第六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

科恩的實驗首次打破了不同物種在億萬年中形成的天然屏障，他的成功標(biāo)志著任何不同種類生物學(xué)基因都能通過基因工程技術(shù)重組到一起，人類可以根據(jù)自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，甚至創(chuàng)造新的生命類型。人類歷史上第一次具備了精確、細(xì)致地控制生物生長過程的能力。比如：我們可以從在極地生活的魚類中提取抵御嚴(yán)寒的基因，再把它們插入到草莓中去，讓草莓也能在極寒的地區(qū)生存。如今，基因重組技術(shù)在生產(chǎn)醫(yī)藥上重要的藥物以及在農(nóng)牧業(yè)育種等領(lǐng)域中取得了很多成果。第七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

對于基因工程，范圍是相當(dāng)廣泛的。如對于基因工程動物而言，就有轉(zhuǎn)基因、基因替換、內(nèi)源基因敲除等類型的基因工程動物。本章僅重點介紹基因工程中的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，即：將通過人工操作的方式將外源基因整合到生物體基因組內(nèi)，使該轉(zhuǎn)基因生物能穩(wěn)定地將此基因遺傳給后代的實驗技術(shù)。第八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

基因轉(zhuǎn)移的方法

物理方法化學(xué)方法生物學(xué)方法9．1．1細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因的方法第九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

向細(xì)胞中導(dǎo)入外源基因是定向改變細(xì)胞遺傳性狀的常用手段。要使外源基因有效地轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞首先要選擇合適的受體細(xì)胞其次要有可靠的轉(zhuǎn)化后篩選方法

常用的哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染(接受外源基因)的方法有兩種：(1)暫時轉(zhuǎn)染：質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中不必停留很長時間，DNA被轉(zhuǎn)錄成mRNA，隨后翻譯成蛋白，并不進(jìn)入細(xì)胞基因組。磷酸鈣沉淀法、DEAE—葡聚糖法均為暫時轉(zhuǎn)染。

(2)永久性轉(zhuǎn)染：反轉(zhuǎn)錄病毒載體法可以產(chǎn)生永久有效的轉(zhuǎn)染。第十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(一)電穿孔法這種方法利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，在細(xì)胞膜上形成納米級的微孔，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。這種方法簡單、效率較高，因而廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。將受體細(xì)胞懸浮于含有待轉(zhuǎn)化DNA的溶液中，在盛有上述懸浮液的電擊池兩端施加短暫的脈沖電場，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的空洞達(dá)到增加通透性的效果；此時，外源DNA片段能不經(jīng)過胞飲作用就能直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。物理方法第十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

第十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

第十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

（二)微注射法顯微注射法主要用于制備轉(zhuǎn)基因動物。基本操作方法如下9-2。通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄鼠交配，然后處死雌鼠，取出受精卵。然后借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入受精卵中變大的雄核內(nèi)。將該受精卵移植到另外一只假受孕母鼠的輸卵管內(nèi)，正常發(fā)育、繁殖出轉(zhuǎn)基因鼠。第十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

擁有長壽基因的鼠第十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

優(yōu)點：這種方法轉(zhuǎn)入的基因長度可達(dá)數(shù)百kb，并能隨機(jī)地整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，因此應(yīng)用范圍廣。

缺點：但是這種整合有時會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物基因組的重排、易位、缺失或定點突變。第十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(三)裸露DNA直接注射法將裸露DNA直接注射到組織中，DNA有可能直接被細(xì)胞所攝入。這是最簡單的基因轉(zhuǎn)移方法。但是轉(zhuǎn)移效率較低第十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

基因轉(zhuǎn)移的化學(xué)方法主要包括：DEAE－葡聚糖法、磷酸鈣－DNA共沉淀法、脂質(zhì)體載體包埋法等。

主要原理：通過改變細(xì)胞膜的通透性或者增加DNA與細(xì)胞的吸附而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。

化學(xué)方法第十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(一)DEAE－葡聚糖法

最早的動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法；主要是將外源DNA片段與DEAE－葡聚糖等高分子碳水化合物混合，這樣DNA鏈上帶負(fù)電的磷酸骨架便被吸附于DEAE正電荷基團(tuán)上，從而形成DNA大顆粒。后者黏附于受體細(xì)胞表面，并通過胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。該方法的轉(zhuǎn)化率較低。第十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

（二）磷酸鈣-DNA共沉淀法二價金屬離子能促進(jìn)細(xì)菌吸收外源DNA

當(dāng)核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式存在時，細(xì)胞攝取DNA的能力顯著加強(qiáng)。第二十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

第二十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸根離子的緩沖液中，此時磷酸鈣與DNA共沉淀形成大顆粒。加入受體細(xì)胞培養(yǎng)一段時間后，DNA就通過脂相收縮時裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞，或者在鈣、磷的誘導(dǎo)作用下被細(xì)胞吞噬而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而使外源DNA整合到受體細(xì)胞中得到表達(dá)。

該方法的轉(zhuǎn)染效率雖比DEAE－葡聚糖法高出約100倍，但還是比較低，僅有1％－5％的外源DNA可以進(jìn)入受體細(xì)胞核中，大約僅有1％的DNA可以在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。第二十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

（三）脂質(zhì)體載體包埋法脂質(zhì)體為人工膜泡，可作為體內(nèi)外物質(zhì)傳送的裁體。將需轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜類似，因此可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。這種方法轉(zhuǎn)基因效率高。第二十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

第二十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

將待轉(zhuǎn)移的DNA溶液與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑存在的條件下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。當(dāng)這種脂質(zhì)體懸浮液中加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中便會與受體細(xì)胞膜發(fā)生融合，DNA片段隨即進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，第二十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)方法主要是病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。根據(jù)受體細(xì)胞類型不同可選擇不同宿主范圍和不同感染途徑的病毒基因組作為轉(zhuǎn)化載體。目前常用的病毒載體包括DNA病毒載體(腺病毒載體、牛痘病毒載體等)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。生物學(xué)方法第二十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

對于DNA病毒載體，以腺病毒載體為例。腺病毒基因組DNA全長36kb，其包裝上限為原基因組的105％、即37.8kb。

優(yōu)點安全性好、不整合人染色體、不導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、宿主范圍廣、對受體細(xì)胞分裂周期要求不嚴(yán)、外源基因在載體上容易高效表達(dá)。第二十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是一種傳染性病毒，含有RNA遺傳物質(zhì)，可將非病毒基因轉(zhuǎn)移至分裂細(xì)胞。感染進(jìn)細(xì)胞的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA互補鏈，該DNA又可以作為合成第二條DNA鏈的模板。這兩條DNA鏈可滲入受體細(xì)胞的基因組DNA中。之后，病毒利用宿主細(xì)胞的酶體系自行轉(zhuǎn)錄與復(fù)制、從而可以使病毒單拷貝基因組穩(wěn)定地進(jìn)宿主細(xì)胞。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以獲得穩(wěn)定、有效的轉(zhuǎn)染，可用于不易轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或原代培養(yǎng)細(xì)胞。第二十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

但是病毒載體也具有一些缺陷

如：

1、所有病毒載體都會誘導(dǎo)產(chǎn)生一定程度的免疫反應(yīng)

2、或多或少存在一定的安全隱患

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)能力有限，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。第二十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

1、可以設(shè)計含有抗藥性基因的外源DNA載體，然后通過選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選。2、可以通過提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNA，以適當(dāng)限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行Southern轉(zhuǎn)移分析，檢驗細(xì)胞中是否有被轉(zhuǎn)移的外源基因。9.1.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定第三十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一9.2.1定義與發(fā)展歷史

轉(zhuǎn)基因動物是指在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合以實驗方法導(dǎo)入的外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代的遺傳工程動物。9.2

轉(zhuǎn)基因動物第三十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一1974年，Jaenish和Mintz應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了AV40DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。

1980年，Gordon等人首先育成帶有人胸苷激酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。

Palmiter等人于1982年將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，獲得了比普通對照小鼠生長速度快2-4倍、體形大一倍的轉(zhuǎn)基因“碩鼠”，從此轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)轟動了整個生命科學(xué)界。第三十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

它使人們看到了利用此技術(shù)在建立人類疾病動物模型、加速動物育種、研究真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以及在哺乳動物特異組織系統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn)人的藥用蛋白等方面令人鼓舞的前景。第三十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

在隨后的十幾年里，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因綿羊、轉(zhuǎn)基因豬、轉(zhuǎn)基因牛和轉(zhuǎn)基因山羊陸續(xù)育成除哺乳動物外，科學(xué)家還分別合成了轉(zhuǎn)基因魚、轉(zhuǎn)基因雞，這些開創(chuàng)性的工作使人們可以從分子、細(xì)胞和個體多水平層次，從發(fā)育時間和組織生理空間多角度、立體地研究基因的功能，使人類按照自己的意愿修正和改造物種。第三十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一9．2．2．1原理與方法隨著分子生物學(xué)與哺乳動物胚胎操作技術(shù)的不斷發(fā)展，將外源目的基因?qū)朐缙谂咛ヅ嘤D(zhuǎn)基因動物已經(jīng)由可能變成了現(xiàn)實。

以動物個體為受體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)首先是從小鼠開始的，轉(zhuǎn)基因小鼠為研究特定基因及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了獨特的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

但就經(jīng)濟(jì)效益而言，大型家畜動物的轉(zhuǎn)基因動物更具有開發(fā)價值。9．2．2轉(zhuǎn)基因動物的制備第三十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

基于基因工程的基本原理與技術(shù)方法，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的關(guān)鍵技術(shù)包括：外源目的基因的制備；外源目的基因有效的導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞；

選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定；篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物品系。第三十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

轉(zhuǎn)基因動物研究的核心技術(shù)是如何成功地把目的基因轉(zhuǎn)入動物早期胚胎細(xì)胞中。主要方法：基因顯微注射法胚胎干細(xì)胞移植法反轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體導(dǎo)入法第三十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

（一）原核期胚胎顯微注射法基因顯微注射法是由美國人Gordon發(fā)明的,也是一種比較經(jīng)典、應(yīng)用比較廣泛、效果比較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因?qū)敕椒?。首例表達(dá)人胸苷激酶基因、人生長激素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠都是利用這種方法獲得成功的。目前采用這種方法已成功培育出轉(zhuǎn)基因小鼠、豬、綿羊、免和牛。第三十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

基本原理是：

通過顯微操作儀將外源基因直接用注射器注入受精卵(雄原核內(nèi))，利用受精卵繁殖中DNA的復(fù)制過程，將外源基因整合到DNA中，再發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。第三十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

具體而言，基因顯微注射法主要包括以下幾個步驟：

(1)DNA的制備與純化

(2)動物的挑選、超排卵與取卵

(3)DNA的顯微注射

(4)卵的轉(zhuǎn)移

(5)轉(zhuǎn)基因動物的獲得第四十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

（二）反轉(zhuǎn)錄病毒感染法反轉(zhuǎn)錄病毒的核酸為一條單鏈RNA分子。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，RNA首先編碼出反轉(zhuǎn)錄酶，在酶作用下，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈分子，DNA通過一種尚未明確的機(jī)制整合列宿主細(xì)胞DNA中。方法:1)將目的基因重組到反轉(zhuǎn)錄病毒載體上，人為感染著床前或著床后的胚胎，

2)直接將胚胎與能釋放反轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染目的，就可通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中。第四十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

由于反轉(zhuǎn)錄病毒的高效率感染和在宿主細(xì)胞DNA上的高度整合特性，借此可以大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率。

應(yīng)用該方法已成功培育出轉(zhuǎn)基因雞和牛。第四十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

胚胎干細(xì)胞(ES)是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(1cM)中分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能細(xì)胞。在某種意義上也可以說，它是一種含正常二倍染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞，能分化為成體動物的所有組織(包括生殖細(xì)胞)。在發(fā)育上類似于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、當(dāng)被注入囊胚腔后可以參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織嵌合體的形成。因此只要將外源DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞就可以實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。(三)胚胎干細(xì)胞方法第四十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

第四十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

以胚胎干細(xì)胞作為外源基因引入的載體有許多方法，包括：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合等。還可以如圖9-6所示的那樣，

外源DNA轉(zhuǎn)化ES細(xì)胞后再通過核移植產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，

也可以通過聚合法或注射法產(chǎn)生嵌合體，經(jīng)過嵌合體的繁育獲得轉(zhuǎn)基因動物。第四十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

利用ES細(xì)胞途徑獲得轉(zhuǎn)基因動物的關(guān)鍵之處是ES細(xì)胞的分離和獲得。當(dāng)外源基因移入到ES細(xì)胞基因組后，既能高效穩(wěn)定表達(dá)，又不影響ES細(xì)胞的各種功能。ES細(xì)胞不僅使轉(zhuǎn)基因的成功率大大提高，而且使基因剔除、基因誘捕等技術(shù)成為可能。第四十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

采用胚胎干細(xì)胞方法和胚胎移植技術(shù)實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物制備的基本具體步驟

1、從胚胎分離出胚胎干細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)錄將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，再將其轉(zhuǎn)入到植入前胚胎的胚泡腔。

2、這些帶有外源基因的胚胎干細(xì)胞可嵌入宿主囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中參與胚胎發(fā)育、出生的動物其生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因

3、通過雜交繁育就可得到具有純合目的基因的個體，即轉(zhuǎn)基因動物。第四十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(四)精子載體法由于顯微注射技術(shù)的效率很低，加之設(shè)備昂貴，因此人們一直在試圖尋找一種簡單、有效和廣泛適用的方法將外源基因?qū)氲饺我夥N類動物(如哺乳類、禽類及魚類)的基因組內(nèi)。第四十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

精子載體法是一種直接用精子作為外源DNA載體的轉(zhuǎn)移方法?；驹砗头椒ㄊ牵壕又苯优c外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以直接進(jìn)入精子頭部，受精后就可發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。第四十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

后來羅特曼(Rottman)對此方法進(jìn)行了改進(jìn)，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質(zhì)體包埋，使脂質(zhì)體與DNA相互作用形成脂質(zhì)體—DNA復(fù)合物。這種復(fù)合體比較容易和精子細(xì)胞融合，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。我國學(xué)者使用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行操作，方便、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)染率高。盡管該方法的可靠性尚有爭論，但是由于它的經(jīng)濟(jì)性與方便性，許多研究者在進(jìn)行該方法的改進(jìn)工作。第五十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（五）人工酵母染色體法人工酵母染色體是近年來才發(fā)展起來的一種新型載體，具有克隆百萬堿基對級的大片段DNA的能力。

1992年人們采用該方法獲得了具有百萬堿基對外源DNA的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種方法最明顯的優(yōu)點是可以保證巨大基因的完整性及較長外源基因片段在轉(zhuǎn)基因動物中的較高的整合率。第五十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(六)受精前卵細(xì)胞顯微注射法

受精前卵細(xì)胞顯微注射法是將外源基因克隆至反轉(zhuǎn)錄病毒載體，然后將這一攜帶外源目的基因的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒通過顯微注射技術(shù)，注入到受精前卵細(xì)胞的卵周腔，然后再體外受精，培養(yǎng)至囊胚期，移入假孕的雌性動物子宮內(nèi)發(fā)育。第五十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一這種方法的優(yōu)點主要體現(xiàn)在以下兩個方面：

(1)目前大型動物轉(zhuǎn)基因普遍采用原核顯微注射法，但是大型動物受精卵的原核不如小鼠等的清晰可見，因此給顯微注射帶來極大不便。目前采用離心等方法顯現(xiàn)原核，效果也不理想。而采用受精前卵細(xì)胞顯微注射法就可能避免這一難題。第五十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

能使首代轉(zhuǎn)基因動物陽性率顯著提高。而且，由于僅需將外源基因注射進(jìn)卵細(xì)胞周腔即可，不需刺破細(xì)胞質(zhì)膜及原核膜，所以對卵造成的機(jī)械損傷極小，因此注射后的卵細(xì)胞成活率顯著提高。第五十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(2)與傳統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄病毒法相比，這種方法也有了明顯改進(jìn)：首先，選用受精前卵細(xì)胞作為外源基因的轉(zhuǎn)入點，讓外源基因比精子染色質(zhì)先進(jìn)入卵細(xì)胞，這樣，只要發(fā)生外源基因的整合，每一個細(xì)胞都會攜帶外源基因．從而避免了嵌合體動物的產(chǎn)生。第五十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

其次，由于在體外培養(yǎng)的卵細(xì)胞在MⅡ期包裹染色體的核膜會暫時消失，因此在這個時候進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)入，可大大提高外源基因進(jìn)入核內(nèi)與核染色體接觸的機(jī)會。第三，受精前卵細(xì)胞比受精卵和早期胚胎更易轉(zhuǎn)染反轉(zhuǎn)錄病毒，因此可以提高外源基因的整合率。第五十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（七）其他方法

除了以上方法之外，動物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)還有電脈沖法、染色體片段注入法、磷酸鈣共沉淀法、微彈轟擊法、原生質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因剔除和基因嵌入等。這些方法大多具有一些特殊的優(yōu)勢。第五十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一9．2．2．2轉(zhuǎn)基因動物鑒定技術(shù)

早期采用的、也是目前具有權(quán)威性的轉(zhuǎn)基因動物鑒定技術(shù)是southernblotting。

具體步驟是：提取待檢動物組織的染色體(一般選擇導(dǎo)入基因中的單一限制酶位點)，消化后電泳，轉(zhuǎn)膜后選擇適當(dāng)?shù)奶结樳M(jìn)行雜交，通過放射自顯影獲得結(jié)果。

該方法的優(yōu)點是結(jié)果可靠，但缺點是工作量大、操作繁瑣。第五十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

另外一種比較常見的方法是斑點雜交；主要步驟包括：動物DNA的提取、點于硝酸纖維素膜、探針雜交、放射自顯影。

優(yōu)點：操作簡便，

缺點：當(dāng)動物體內(nèi)整合的外源基因與內(nèi)源基因有同源時，往往出現(xiàn)假陽性。另外由于提取的染色體DNA濃度較高，雜交效果往往不十分理想。因此這種方法用于轉(zhuǎn)基因動物的篩選并不多。第五十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用使轉(zhuǎn)基因動物的篩選工作大大簡化。

只需設(shè)計一對特異性引物，以組織提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析就可以實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物的鑒定。缺點：有時也會存在假陽性，對篩選工作影響較大，必須加以克服。第六十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

除了以上方法，近年來不斷出現(xiàn)一些新技術(shù)。例如，可用染色體原位雜交的方法鑒定轉(zhuǎn)基因豬，雖然操作比較繁瑣、但其獨到之處是可確定出外源基因在染色體上的整合位點以及整合狀態(tài)。第六十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是在20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的。從這項技術(shù)誕生的那天起，它就在改良畜禽生產(chǎn)性狀、提高畜禽抗病力以及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜牧產(chǎn)品(如人類藥用蛋白)等方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。

9.2.2轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的意義與最新進(jìn)展第六十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體性狀的可遺傳修飾。轉(zhuǎn)基因動物就是基因組中含有外源基因的動物。通過生長素基因、多產(chǎn)基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生蟲基因、抗病毒基因等基因轉(zhuǎn)移，可能育成生長周期短、產(chǎn)仔、生蛋多、泌乳量高或抗病性強(qiáng)的動物目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已在牛、羊、豬、雞、魚等家養(yǎng)動物中取得一定成果9.2.2轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的意義與最新進(jìn)展第六十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一熒光鼠

2007年末，熒光鼠腦細(xì)胞的圖片傳遍世界各地，從“福利客”超市的宣傳海報到“自然”雜志的封面。這些五彩斑斕的腦細(xì)胞是單個的神經(jīng)元，鮮艷的色彩幫助科學(xué)家將它們區(qū)分開來。英國哈佛大學(xué)的杰夫-里奇曼為首的科研小組在實驗鼠的基因組中導(dǎo)入水母的綠色熒光蛋白基因，使其在紫色光線的照射下呈現(xiàn)出綠色熒光。這種綠色熒光基因?qū)π∈鬅o害，只起到標(biāo)記作用。十大神奇轉(zhuǎn)基因動物第六十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一這種轉(zhuǎn)基因山羊是獨一無二的，因為它們能產(chǎn)生普通的蜘蛛絲。這種構(gòu)成蜘蛛網(wǎng)的同樣物質(zhì)由它們的乳腺產(chǎn)生。很多科學(xué)家把蜘蛛絲叫做“生物鋼”，有著超強(qiáng)的抗張強(qiáng)度。研究人員稱，如果把很多蜘蛛絲擰成一股繩的話，它足夠強(qiáng)韌，可制成防彈背心、降落傘繩，或者從飛機(jī)到航母等設(shè)備。蜘蛛絲還可被制成人造韌帶和人造腱，支撐組織、骨骼和神經(jīng)細(xì)胞，讓它們在生長期間保持穩(wěn)定。隨著細(xì)胞的逐漸生長，這些人造絲部分會逐漸分解。幫助“生產(chǎn)”這些山羊的懷俄明大學(xué)分子生物學(xué)家蘭迪-劉易斯說：“從概念上講，這個過程非常簡單。用于絲蛋白的蜘蛛絲基因與控制蛋白質(zhì)構(gòu)成組織的山羊的DNA有關(guān)。在這種情況下，它是乳腺，只形成于哺乳期。然后，細(xì)胞與卵結(jié)合生成胚胎，胚胎有著合成其DNA的基因。當(dāng)母羊開始分泌乳汁時絲蛋白就產(chǎn)生了十大神奇轉(zhuǎn)基因動物蜘蛛羊第六十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一美國研究人員通過一項新技術(shù)，使得老鼠具有了抵抗各種癌癥的能力，而這個科學(xué)突破將使癌癥患者有望接受無副作用的治療。這些老鼠內(nèi)產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)是未來療法的關(guān)鍵，它能消滅腫瘤細(xì)胞，卻不會傷害體內(nèi)的健康組織。通常情況下，一般的癌癥治療會使患者出現(xiàn)疼痛、惡心和掉頭發(fā)等情況。科學(xué)家們希望有朝一日把這種蛋白質(zhì)用于癌癥患者身上，使他們擺脫這些痛苦。這個突破取決于一種叫Par-4的老鼠基因，它生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。研究人員讓一組老鼠擁有比正常情況下更多的蛋白質(zhì)。后來他們發(fā)現(xiàn)，這些老鼠對許多癌癥類型產(chǎn)生免疫力，像肝癌和前列腺癌等。測試顯示，這種蛋白質(zhì)還能抵抗乳腺癌、胰腺癌和頭頸癌等。美國的這些科學(xué)家們表示，至關(guān)緊要的一點是這些老鼠沒有出現(xiàn)任何明顯的副作用。十大神奇轉(zhuǎn)基因動物抗癌老鼠第六十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一翡翠海參看起來更像一片樹葉，而不是黏滑的腹足軟體動物，但它卻是已知第一種在自然演化過程中發(fā)生轉(zhuǎn)基因現(xiàn)象的物種。能夠利用水藻食物中的葉綠體進(jìn)行光合作用以產(chǎn)生能量。沒有任何其他動物能夠這樣利用葉綠體。朗波研究發(fā)現(xiàn)海參中的一種基因與水藻中具有光合作用的基因類似，這表明在過去的漫長歲月中，該基因或許通過自然進(jìn)化的方式從水藻轉(zhuǎn)移到海參的DNA中。雖然目前還很難證實海參身上的這種基因轉(zhuǎn)移，但朗波仍表示“我們正致力于探究這種轉(zhuǎn)移是如何發(fā)生的”，這將有利于科學(xué)家探索動植物間的基因轉(zhuǎn)移是否會發(fā)生在其他的物種上十大神奇轉(zhuǎn)基因動物翡翠海參第六十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

2003年，美國得克薩斯的一家公司宣布，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因技術(shù)他們已經(jīng)研制出能發(fā)熒光的小型熱帶魚——“熒光魚”。這種“光芒四射”的紅色熒光魚，是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到商標(biāo)注冊的第一種商業(yè)性熒光寵物魚。改基因后的斑馬魚散發(fā)出粉紅色熒光，遠(yuǎn)看像金魚一樣。目前，公司以GloFish的商標(biāo)對紅色熒光魚進(jìn)行了注冊，這標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因熒光魚可以被當(dāng)作家庭寵物出售。斑馬魚是一種常見的觀賞魚，身上有黑白相間的條紋。熒光斑馬魚被分別轉(zhuǎn)入了水母綠色熒光蛋白或者珊瑚蟲紅色熒光蛋白的基因，在紫外線的照射下，能夠發(fā)出綠光或紅光。熒光魚作為觀賞魚在市場上銷售，是第一種上市的轉(zhuǎn)基因動物。十大神奇轉(zhuǎn)基因動物熒光魚第六十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一一種超級老鼠可以不知疲倦地奔跑數(shù)小時、壽命更長、擁有更強(qiáng)繁殖能力、吃得更多而不增加體重……美國科學(xué)家培育出的這種轉(zhuǎn)基因老鼠震撼了世界，引起人們的遐想：培育超級老鼠的技術(shù)手段能否應(yīng)用于人類，改善人類的能力？研究者將高度活躍的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎?；蜣D(zhuǎn)化的老鼠在運動時有效利用身體脂肪產(chǎn)生能量，同時避免產(chǎn)生大量乳酸。科學(xué)家漢森教授說，超級老鼠主要利用脂肪轉(zhuǎn)化能量，體內(nèi)只產(chǎn)生非常微量的乳酸，它們不吃不喝也能跑4到5個小時。這種老鼠最多能以每分鐘20米的速度奔跑6公里，也就是說，它能連續(xù)不間斷奔跑5個小時甚至更多?？茖W(xué)家說，這相當(dāng)于一個人不間斷地高速騎自行車翻越阿爾卑斯山，只有人類頂級運動員可以做到，比如環(huán)法自行車賽七冠王蘭斯-阿姆斯特朗。十大神奇轉(zhuǎn)基因動物超級老鼠第六十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一近年來，全世界科學(xué)家都在努力研究轉(zhuǎn)基因蚊子，以降低其對人類的危害。倫敦帝國學(xué)院的科研小組培育了一種轉(zhuǎn)基因蚊子，其中的雄性具有熒光睪丸，很容易被識別，然后令其不育。研究者稱，可以將大量這樣的轉(zhuǎn)基因蚊子放到野外與普通的雌蚊交配，減少瘧蚊的產(chǎn)卵量，從而慢慢減少瘧蚊的數(shù)目。這種轉(zhuǎn)基因蚊子沒有生育能力，所以不會將基因遺傳給野生蚊子。美國科學(xué)家通過基因改造，在實驗室中培育出了一種蚊子，它具備了不再感染瘧疾的能力，將這些蚊子放入野外可以有效切斷人與蚊子之間的瘧疾傳播途徑。這些經(jīng)過基因改造的蚊子被飼以未感染瘧原蟲的血液時并無明顯優(yōu)勢，不過在飼以含有瘧原蟲的血液后，比普通蚊子更能適應(yīng)環(huán)境。這意味著，跟普通的蚊子相比，這種轉(zhuǎn)基因蚊子的繁殖能力和生存能力更強(qiáng)，死亡率更低。被瘧原蟲感染不會殺死普通蚊子，但是會降低其繁殖率。十大神奇轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因蚊子第七十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一一曾培育出世界上第一只克隆羊“多利”的英國羅斯林研究所，近日又取得了一項重大的科學(xué)突破：該研究所的科學(xué)家成功培育出世界上第一批能下“神奇雞蛋”的小雞。這種經(jīng)過基因改造的小雞所下的蛋能用來制造治療癌癥和其他疾病的藥物。這一重大科學(xué)突破無疑為大規(guī)模生產(chǎn)藥物提供了非常廣闊的前景。科學(xué)家用于研究的小雞名為“依沙褐殼蛋雞”，這種法國品種雞每年可下約300顆雞蛋。經(jīng)過基因改造后的“依沙褐殼蛋雞”，其DNA中含有人為加入的人類基因，當(dāng)母雞生下蛋后，科學(xué)家就能從雞蛋的蛋白中提取用來制造藥物的蛋白質(zhì)。牛津生物醫(yī)藥公司的研究人員安德魯-伍德表示：“從理論上來說，這種技術(shù)適用于不同種類的基因，因此這些母雞也可以被用于制造許多不同的蛋白質(zhì)。未來，這種技術(shù)有望用于治療包括帕金森癥、糖尿病和多種癌癥在內(nèi)的各種疾病十大神奇轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)藥的小雞第七十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一長期以來，科學(xué)家們一直認(rèn)為，動物的恐懼可能是由它們靈敏的嗅覺喚起的。老鼠擁有大約1000個嗅覺感受器基因，而人類只有400個起作用的和大約800個不活躍的嗅覺感受器基因。在用老鼠所做的一項實驗中，研究人員確認(rèn)并移除了老鼠大腦嗅球上的某些感受器，結(jié)果這些老鼠變成了一群無所畏懼的嚙齒動物，在天敵面前轉(zhuǎn)來轉(zhuǎn)去，顯示出極強(qiáng)的好奇心，永遠(yuǎn)不知道危險的存在。十大神奇轉(zhuǎn)基因動物無所畏懼的老鼠第七十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一攜帶細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)基因豬可產(chǎn)生更清潔，污染更少的綠肥。這些基因，可幫助豬除去食物中的磷酸鹽，從而有助減少豬畜牧業(yè)中產(chǎn)生的對農(nóng)業(yè)有害的廢物。在加拿大圭爾夫大學(xué)的豬研究小組成員SergeGolovan說：“植物含有許多有機(jī)磷，而普通豬不能使用它?！睕]吸收的磷流散在環(huán)境中，危害溪流中的生物，產(chǎn)生溫室氣體。轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)過遺傳修飾，在唾液中產(chǎn)生肌醇六磷酸酶，從而可以吸收植物中的磷，而普通豬是不能消化磷的。對轉(zhuǎn)基因豬產(chǎn)生的肥料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，他們比普通豬的排磷量減少了75%。圭爾夫大學(xué)研究小組使用來自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶基因，將該基因插入到豬基因組中，豬的唾液中產(chǎn)生這種酶。這種污染性小的豬所排泄的磷比食用肌醇六磷酸酶的豬要少得多。十大神奇轉(zhuǎn)基因動物有利于改善環(huán)境的基因豬第七十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

由于外源基因可在轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞中整合表達(dá)，并接受受體基因組遺傳背景的調(diào)控，因此可以把轉(zhuǎn)基因作為一個理想的功能標(biāo)記建立相應(yīng)的動物模型；目前所取得的一些成就都得益于轉(zhuǎn)基因動物模型的建立，如：基因協(xié)同表達(dá)、復(fù)合型啟動子/增強(qiáng)子、外源基因的反饋調(diào)節(jié)以及染色體重組等。迄今，利用轉(zhuǎn)基因動物模型的研究已深入到生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究的各個方面，如遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、胚胎學(xué)、組織學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、生理學(xué)、生物進(jìn)化學(xué)等。此外，轉(zhuǎn)基因動物也為病毒研究提供了一個新的體系。9.2.2.1轉(zhuǎn)基因動物模型與基因治療第七十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

目前，可以通過精確地失活某些基因或增強(qiáng)某些基因的表達(dá)來制作各種研究人類疾病的動物模型。

已建立的遺傳疾病轉(zhuǎn)基因小鼠模型有：動脈粥樣硬化、鐮刀形細(xì)胞貧血癥、老年癡呆癥、自身免疫病、淋巴系統(tǒng)病、皮炎和前列腺癌等。

Snyder等將人CD4融合基因?qū)爰彝没蚪M．成功地制作了可用于研究HIV-1感染宿主的動物模型。通過這些模型的建立，將有助于預(yù)防和治療這些疾病。第七十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

具有廣闊發(fā)展前景的基因治療也是依賴于相關(guān)動物模型的建立的。

Cline于1980年最早采用基因治療方法對兩名重癥β-地中海貧血癥進(jìn)行治療，并獲得成功。

我國首次基因治療疾病是在1991年成功治療血友病。盡管基因治療前景廣闊，但是一些遺傳疾病由于找不到安全有效的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和合適的受體細(xì)胞而進(jìn)展緩慢。第七十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一9．2．2．2優(yōu)良動物育種

1982年轉(zhuǎn)基因“碩鼠”的誕生，為運用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)改良畜禽經(jīng)濟(jì)性狀帶來了曙光。人們可以通過外源基因的導(dǎo)入達(dá)到使畜禽生長速度加快、產(chǎn)量(肉、蛋、奶)提高、耗料減少和品質(zhì)改進(jìn)的目的。此后，轉(zhuǎn)基因羊、牛和雞等畜禽也相繼獲得成功，第七十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

采用轉(zhuǎn)基因動物育種技術(shù)具有常規(guī)育種技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢：周期短、成本低、選擇效率高、不受有性繁殖的限制等。因此這方面的應(yīng)用也是轉(zhuǎn)基因動物最具經(jīng)濟(jì)開發(fā)前景的應(yīng)用領(lǐng)域之一。

但是，最需解決的首要問題是如何確保外源基因的穩(wěn)定表達(dá)和遺傳。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已被用于提高生長速度、動物抗病育種、提高綿羊等的產(chǎn)毛性能、抗凍品種培育等領(lǐng)域。第七十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（一）快速生長與肉質(zhì)改善

生長激素(GH)基因是轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用最早的基因。繼Palmiter將大鼠的GH基因?qū)胄∈蠡蚪M中獲得巨型小鼠后，牛、綿羊、人的GH基因也先后導(dǎo)入小鼠基因組中，得到的轉(zhuǎn)基因小鼠在快速生長期(5-11周齡)的生長速度可達(dá)對照組的4倍左右。1985年，科學(xué)家第一次將人的生長激素基因?qū)胴i的受精卵并獲得成功，轉(zhuǎn)基因豬與同窩非轉(zhuǎn)基因豬比較，生長速度和飼料利用效率顯著提高，酮體脂肪率也明顯降低。第七十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

我國學(xué)者用構(gòu)建的GH基因表達(dá)載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，獲得的轉(zhuǎn)基因豬比同類非轉(zhuǎn)基因豬的生長速度提高11.8％—14．2％，飼料利用率提高10%，瘦肉率也有所增加，外源GH調(diào)節(jié)生長的機(jī)制被認(rèn)為是可以刺激宿主動物胰島素生長因子的合成與分泌。第八十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(二)抵抗疾病理論上，對一些種屬特異性的疾病，如果可以從抗該病的動物體中克隆出有關(guān)的基因，并將其轉(zhuǎn)移給易感染動物品種，則有希望培育出抗病品系。

1988年有人將小鼠抗流感基因轉(zhuǎn)入了豬體內(nèi)，使轉(zhuǎn)基因豬增強(qiáng)了對流感病毒的抵抗能力。第八十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（三）增加羊毛產(chǎn)量和性能由于羊毛是角蛋白通過二硫鍵緊密交聯(lián)組成的，而角蛋白對半胱氨酸的需求量很高，因此半胱氨酸是制約羊毛產(chǎn)量的限制性氨基酸。

但是羊胃里的微生物可以降解半胱氨酸，成為二硫化物而損失掉。研究發(fā)現(xiàn)來源于細(xì)菌的絲氨酸轉(zhuǎn)移酶(SAT)、D-乙酰絲氨硫化氫解酶(DAS)可以將二硫化物重新轉(zhuǎn)化成半胱氨酸。因此澳大利亞的研究者以SAT、DAS基因建立轉(zhuǎn)基因羊，并將其定位表達(dá)于胃腸道上皮，從而提高胃腸道中半胱氨酸的量并加以利用，達(dá)到提高羊毛產(chǎn)量的目的。第八十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

此外，將毛角蛋白Ⅱ中間細(xì)絲基因?qū)刖d羊基因組，得到的轉(zhuǎn)基因羊毛光澤亮麗，而且羊毛中的羊毛脂含量明顯提高。第八十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(四)抗凍品種培育美洲擬蝶等魚由于其體內(nèi)存在抗凍蛋白基因(AFP)而能在寒冷環(huán)境中生存，而羅非魚和鯪魚等熱帶魚則抗寒能力低下而不能在溫度較低的地區(qū)生存。建立AFP轉(zhuǎn)基因魚無疑將使熱帶魚對低溫的耐受性增強(qiáng)。第八十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

9．2．2．3在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人類藥用蛋白等非常規(guī)畜牧產(chǎn)品，是目前世界上轉(zhuǎn)基因動物研究的熱點之一。其中，通過動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類藥用蛋白的研究已取得了初步成功。此時的轉(zhuǎn)基因動物不在于動物本身，而是它們身上產(chǎn)出的乳汁可以提取一系列活性物質(zhì)，它們中的每一只都可稱為一座天然基因藥物制造廠。第八十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一目前利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺定位表達(dá)生產(chǎn)的藥物主要包括：（一）抗出血性藥物我國學(xué)者構(gòu)建了人凝血因子Ⅸ的表達(dá)載體，并通過顯微注射轉(zhuǎn)入山羊受精卵的雄原核中，經(jīng)受精卵短期培養(yǎng)，將早期胚胎移植進(jìn)母體山羊發(fā)育，獲得轉(zhuǎn)基因山羊，發(fā)現(xiàn)乳汁中含有凝血因子Ⅸ的濃度為9.17ng／m1，凝血生物活性為50．87％。盡管濃度仍比較低，但是畢竟是一良好的開端。第八十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(二)抗凝血藥物美國Genzyme公司已成功在山羊乳腺中高效表達(dá)抗凝血蛋白AntithrombinⅢ，其活性、結(jié)構(gòu)與天然產(chǎn)物相同，并巳進(jìn)入臨床實驗階段。第八十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(三)血栓治療藥物人體血液中的纖維溶酶能降解纖維蛋白，使血凝塊水解，從而保持血管通暢。纖維溶酶是通過纖維溶酶原激活物(PA)激活其前體纖維溶酶原而形成的。

PA主要有兩種：uPA和tPA。我國已開展了uPA和tPA轉(zhuǎn)基因動物的研究，目前巳在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中得以表達(dá)uPA。第八十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(四)肺氣腫治療藥物

α1-抗胰蛋白酶(α1-AAT)可以抑制肺氣腫釋放的蛋白酶對肺組織的破壞。因此科學(xué)家將含有人類抗胰蛋白酶的基因轉(zhuǎn)入羊中，在其乳汁中得到抗胰蛋白酶。第八十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(五)免疫治療藥物干擾素、白細(xì)胞介素等具有抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等活性，但它們的常規(guī)生產(chǎn)方法是微生物基因工程菌發(fā)酵。近幾年來，人們已經(jīng)開始了采用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)這類藥物的研究。第九十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（六）人型化單克隆抗體利用人免疫球蛋白重鏈c區(qū)的基因建立轉(zhuǎn)基因小鼠后，再用特定抗原免疫小鼠，就可以獲得人型化單克隆抗體。除了轉(zhuǎn)基因動物乳腺制藥外，動物血液制藥也是轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的另外一個重要組成部分。如人造血液的開發(fā)就有廣闊的應(yīng)用前景。將人血紅蛋白基因轉(zhuǎn)入豬，定位表達(dá)于血液，這樣豬血就成為人血的代用品，并可避免輸血時的交叉感染。但目前還有一些技術(shù)問題尚未解決，如轉(zhuǎn)基因血紅蛋白與O2結(jié)合過于牢固，不易釋放，因此難以發(fā)揮輸送O2的功能。第九十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

盡管目前動物生物反應(yīng)器的生產(chǎn)投入和風(fēng)險都很大，但其誘人的商業(yè)前景和潛在的巨額利潤還是吸引了不少投資者和科學(xué)家。有學(xué)者預(yù)言，利用動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物活性蛋白將有望發(fā)展為一個新興的產(chǎn)業(yè)。第九十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

9．2．3．4在異種器官移植中的應(yīng)用人類同種異體器官移植近幾十年來已取得了不錯的效果，但由于其供體來源嚴(yán)重不足，再加上非正常死亡率的下降和人類壽命的延長，人供體器官將更加貧乏。因此，異種器官移植將是解決此問題的主要途徑：第九十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

任何器官的移植，包括腦在內(nèi)，在外科手術(shù)上都已經(jīng)不成問題。移植的主要障礙在于免疫排斥。使器官失去功能。一旦抗排斥治療失敗，便會導(dǎo)致前功盡棄。

要讓家豬真正成為本來人體器官的生產(chǎn)工廠，把器官從豬身上移植到人體，首先要克服的障礙是移植后發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)。這可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到解決，即建立免疫排斥相關(guān)基因轉(zhuǎn)基因豬，如：可先將少量的人類基因注入一至兩個細(xì)胞階段的豬胚胎中去，得到一兩只會天然產(chǎn)生這些保護(hù)性蛋白的轉(zhuǎn)基因小豬。

這些特別培育的家豬的器官組織，因而也就可以存活動在人類的血液中間了。當(dāng)然受體的排斥反應(yīng)是多樣和復(fù)雜的，對此科學(xué)家正在積極尋找解決此類反應(yīng)的辦法。第九十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一該領(lǐng)域的一些其他代表性的例子如下：(一)建立異種抗原缺失或其表達(dá)水平低下的轉(zhuǎn)基因豬由異種抗原介導(dǎo)的超敏反應(yīng)是異種移植臨床應(yīng)用的主要障礙，如異種抗原α1，3-半乳糖。方法：1、可以通過基因敲除技術(shù)靶向性地使與α1，3-半乳糖的合成密切相關(guān)的基因(如，α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因)失活．從而使α1，3-半乳糖缺失；2、轉(zhuǎn)入一些相關(guān)酶基因下調(diào)α1，3-半乳糖的合成。這種可降低超敏反映的效果已在動物模型中得以證實。第九十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(二)建立HLA轉(zhuǎn)基因豬采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將人體相容性抗原如HLA-D、HLA-G等的基因轉(zhuǎn)移至豬體內(nèi)并獲表達(dá)，建立HLA轉(zhuǎn)基因豬，這樣的轉(zhuǎn)基因豬用于人體器官移植的供體，將會具有較低的免疫排斥反應(yīng)：第九十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(三)建立人補體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59的轉(zhuǎn)基因豬通過將人體CD55、CD59基因轉(zhuǎn)入豬的基因組中，其仔豬的血管內(nèi)皮細(xì)胞會表達(dá)CD55、CD59。當(dāng)攜帶這種基因的豬器官(如心臟)移植到人體內(nèi)后，將不會激活人體的補體系統(tǒng)，因此就可以克服超急性排斥反應(yīng)。第九十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

目前，通過采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已使一些超敏反應(yīng)得以克服。由于異種移植的免疫排斥反應(yīng)涉及很多方面，比較復(fù)雜。不能僅考慮一方面的因素。因此建立聯(lián)合型轉(zhuǎn)基因豬的效果會更好，即同時轉(zhuǎn)入多個相關(guān)基因到一只豬體內(nèi)，或者通過不同轉(zhuǎn)基因豬之間的自然交配，使其形成抗異種免疫排斥的特性組合。今后面臨的主要問題是如何克服抗異種免疫排斥的能力，增強(qiáng)被移植器官的存活能力。第九十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一9．2．3．5轉(zhuǎn)基因動物研究的最新進(jìn)展

日前轉(zhuǎn)基因動物的研究日新月異，主要體現(xiàn)在新型外源基因的轉(zhuǎn)入和新型制作方法兩個方面。一些代表性的進(jìn)展如下：第九十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(一)轉(zhuǎn)線粒體（基因）動物線粒體是普遍存在于動植物細(xì)胞內(nèi)的一種細(xì)胞器。轉(zhuǎn)線粒體的嘗試最早可遲溯到1989年，埃伯特(Ebert)將異源線粒體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎，經(jīng)過注射的胚胎移植后發(fā)育正常。但在出生的仔鼠種檢測不到異源線粒體。

轉(zhuǎn)線粒體基因與轉(zhuǎn)核基因存在許多明顯的不同之處，這主要是因為核基因與線粒體基因的表達(dá)特征不同。目前這方面的研究報道還不多見。第一百頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(二)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注射MII期的卵母細(xì)胞這種方法是對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染發(fā)育早期的動物胚胎方法的改進(jìn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體介導(dǎo)的基因整合的關(guān)鍵在于有絲分裂時出現(xiàn)核膜分解。

由于處于減數(shù)分裂中期(MⅡ)的卵母細(xì)胞無核膜的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于處于有絲分裂M期的細(xì)胞，因此為反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因插入提供了更大的可能性。第一百零一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（三）精子與外源基因合并注射卵母細(xì)胞以前采用將精子與外源基因共孵育一段時間，然后通過人工受精的方法制備轉(zhuǎn)基因動物，最近，Anthony報道了一種新方法：首先將精子與外源基因共孵育1min，然后將精子的頭部顯微注射進(jìn)MⅡ期的小鼠卵母細(xì)胞。結(jié)果證實可以提高轉(zhuǎn)基因效率，而且操作程序得以簡化。第一百零二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一9．3轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了3個不同的歷史階段。

最早期是天然藥物,如中草藥(或加工成中成藥),這是第一步。

但人類并不滿足于此,以后通過化學(xué)方法合成新的藥物。合成的藥物成份單純,有些是天然沒有的,有些是對天然藥物的改進(jìn),使它更為有效。第一百零三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

到了70年代后期,隨著DNA重組技術(shù)的問世,誕生了基因工程藥物或簡稱基因藥物。高產(chǎn)值、高效率的基因藥物的出現(xiàn)給藥物生產(chǎn)帶來了一場革命,推動了整個醫(yī)藥業(yè)的發(fā)展。1982年美國Lilly公司首先將重組胰島素投放市場。標(biāo)志著世界第一個基因工程藥物的誕生。第一百零四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一基因工程藥物1、定義：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用某一種生物體生產(chǎn)這種外源基因表達(dá)的活性物質(zhì)2、生產(chǎn)基因工程藥物的基本方法是：

1）、將目的基因用DNA重組的方法連接在載體上

2）、將載體導(dǎo)入靶細(xì)胞(微生物、哺乳動物細(xì)胞或人體組織靶細(xì)胞)3）、使目的基因在靶細(xì)胞中得到表達(dá)

4）、將表達(dá)的目的蛋白質(zhì)提純、加工成制劑，從而成為蛋白類藥或疫苗。第一百零五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

現(xiàn)有或正在開發(fā)中的基因工程約物大致有以下幾類：單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、干擾素、白介素、生長因子、重組可溶性受體、反義藥物、人生長激素、織纖溶酶原激活劑、凝血因子、集落細(xì)胞刺激因子、促紅細(xì)胞生成素。第一百零六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

這里討論的生物反應(yīng)器是指通過基因改造的生物體。

顯然，它是有別于傳統(tǒng)的化工和生物工程領(lǐng)域的反應(yīng)器。第一百零七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器經(jīng)歷三個發(fā)展階段．即：細(xì)菌基因工程、細(xì)胞基因工程、轉(zhuǎn)基因動物。

若按照自然界生物的種類，生物反應(yīng)器主要包括轉(zhuǎn)基因微生物(主要是細(xì)菌)生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器。

生物反應(yīng)器可以使用不同的生物體，其中以微生物居多。最早的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器是通過原核生物來表達(dá)目的基因蛋白。目前市場上的基因工程藥物絕大多數(shù)是采用這一方法。第一百零八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

對于細(xì)菌或細(xì)胞基因工程的生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)傳統(tǒng)發(fā)酵工程技術(shù)

主要過程基因菌的構(gòu)建與篩選

發(fā)酵培養(yǎng)

分離和純化等。

微生物基因工程菌培養(yǎng)方法有兩大缺陷：

一是細(xì)菌等微生物本身是低等生物，構(gòu)建好的哺乳動物或人類的基因?qū)牒蟛荒芎芎帽磉_(dá)；9．3．2轉(zhuǎn)基因微生物反應(yīng)器第一百零九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

二是即使表達(dá)了，產(chǎn)物往往沒有活性，必須經(jīng)過糖基化、羧基化等一系列修飾加工才能成為有效的藥物，這個過程相當(dāng)復(fù)雜，在成本和工藝上都存在許多問題。第一百一十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，過去只能從稀有植物乃至其他生物體才能夠獲得的，或者收獲量甚微的一些具有商業(yè)價值的物質(zhì)，現(xiàn)在已有可能利用栽培作物來進(jìn)行生產(chǎn)了。9．3．2轉(zhuǎn)基因植物反應(yīng)器第一百一十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

基因工程使得植物體正在成為具有重要經(jīng)濟(jì)價值的異源蛋白(包括要用蛋白)的生物反應(yīng)器。

據(jù)不完全統(tǒng)計，迄今為止，國內(nèi)外已經(jīng)有幾十種藥用蛋白質(zhì)或多肽在植物中得到成功表達(dá)，其中包括人的細(xì)胞因子、表皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的一些藥物如表9—2所示。第一百一十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第一百一十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

在植物中生產(chǎn)藥用蛋白多肽最早的例子之一是

利用植物貯藏蛋白的天然的高水平表達(dá)特性，生產(chǎn)人的神經(jīng)肽-亮氨酸腦啡肽。它是一個含有5個氨基酸殘基的小分子多肽，在油菜中先以種子貯藏蛋白2S清蛋白的形式被生產(chǎn)出來。后經(jīng)胰蛋白酶水解將其從貯藏蛋白質(zhì)上切割下來，再通過HPLC予以回收，在臨床上空作為止痛劑或鎮(zhèn)靜劑使用。第一百一十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

利用植物生產(chǎn)藥用蛋白的另外一條途徑是使用基因工程植物病毒作載體，這類載體可瞬時高效表達(dá)大量外源蛋白，是農(nóng)癌桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)等所不能做到的，已有十幾種植物病毒被改造成不同類型的外源蛋白表達(dá)載體，包括花椰菜花葉病毒(CaMv)、煙草花葉病毒(TMV)和豇豆花葉病毒(cPMv)等。第一百一十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

其中超過150多種的蛋白多肽在TMV載體中成功表達(dá)。

利用融合抗原表達(dá)策略已生產(chǎn)出含有瘧疾、動物口蹄疫病毒、鼻病毒及人免疫缺陷病毒(HIV)抗原決定簇的嵌合外殼蛋白，這類融合蛋白的生產(chǎn)方式將來可能是生產(chǎn)疫苗的一條重要和經(jīng)濟(jì)有效的途徑。第一百一十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

細(xì)菌基因工程的缺陷,使人們想到用哺乳動物細(xì)胞株替代工程細(xì)菌,這就出現(xiàn)了第2階段的基因藥物,即細(xì)胞基因工程。

細(xì)胞基因工程解決2個問題:

第1,它能夠表達(dá)人或哺乳動物的蛋白;

第2,哺乳動物細(xì)胞具備對蛋白進(jìn)行修飾加工的條件。

用這樣的方法可以生產(chǎn)出有生物活性的產(chǎn)品,如用這種方法生產(chǎn)的人凝血因子IX就是一種代表性產(chǎn)品。9．3．3轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器第一百一十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

然而細(xì)胞基因工程也有不足之處,因為人或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)要求的條件相當(dāng)苛刻,成本太高,這樣就限制了細(xì)胞基因工程的發(fā)展。第一百一十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

由此人們又想到，是否能將人類所需要的目的基因直接導(dǎo)入哺乳動物如鼠、兔、羊、豬等體內(nèi)，使這種目的基因在哺乳動物體內(nèi)表達(dá)，從而獲得目的基因的產(chǎn)品。

轉(zhuǎn)基因動物是遺傳學(xué)史上具有里程碑意義的工程，開創(chuàng)了生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的新途徑。但是，導(dǎo)入的藥物蛋白基因所表達(dá)的部位與原來的期望往往不一致。因此如何讓藥物蛋白基因表達(dá)控制在某一特定部位，就成了關(guān)鍵的一個技術(shù)問題。第一百一十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

由于轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器具有很多優(yōu)越性，因此它既是轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的重要方面，也是21世紀(jì)生物醫(yī)藥發(fā)展的一個重要方向。第一百二十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

就基因藥物而言，最理想的表達(dá)場所是動物的乳腺。（why?）1、乳腺是一個外分泌器官，乳汁不進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，因此不會影響到轉(zhuǎn)基因動物本身的生理代謝反應(yīng)。2、從轉(zhuǎn)基因乳汁中獲取目的基因產(chǎn)物，不但產(chǎn)量高、易提純，而且表達(dá)的蛋白經(jīng)過充分的修飾加工、具有穩(wěn)定的生物活性。因此稱之為動物乳腺生物反應(yīng)器。所以用乳腺表達(dá)人類所需的蛋白基因的羊、牛等就相當(dāng)于一座制藥工廠。

3、細(xì)菌基因工程、轉(zhuǎn)基因的動植物細(xì)胞培養(yǎng)等均需要很大的車間，而且后者代價昂貴，若用轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器，則只需養(yǎng)殖動物即可。第一百二十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

現(xiàn)已證明利用轉(zhuǎn)基因豬的血液生產(chǎn)具有生物活性的人類血紅蛋白是可行的，我們稱之為動物血液生物反應(yīng)器。下面分別對動物乳腺與血液生物反應(yīng)器作一介紹：第一百二十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

乳腺生物反應(yīng)器的原理

將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列之下使外源基因在乳腺中表達(dá)，然后通過回收乳汁獲得重要價值的生物活性蛋白。9.3.3.1動物乳腺生物反應(yīng)器第一百二十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

1985年，有人提出利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的想法。

1991年，英國科學(xué)家將人的α1-抗胰蛋白酶基因轉(zhuǎn)入綿羊受精卵，成功地獲得了5只轉(zhuǎn)基因綿羊，其中4只母綿羊乳中都表達(dá)了人的α1-抗胰蛋白酶，而且從綿羊乳中純化的α1-抗胰蛋白酶與人血漿中的α1-抗胰蛋白酶具有相同的生物學(xué)活性。第一百二十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

技術(shù)上就是將人的α1-抗胰蛋白酶基因通過顯微操作注進(jìn)母羊受精卵的雄性細(xì)胞核，并使之于羊本身的基因整合起來，形成一體，這種新的基因組可以穩(wěn)定地遺傳到出生的小羊身上。小綿羊也成了人工創(chuàng)造的與它們母親不同的新品系，它們的后代也將帶有這種α1-抗胰蛋白酶基因。

我國科學(xué)家也成功培育了乳汁中含有活性人凝血因子Ⅸ的轉(zhuǎn)基因綿羊。以轉(zhuǎn)基因牛乳腺生物反應(yīng)器的制備流程為例，其制備流程示意圖如圖9-7。第一百二十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人類藥用蛋白的生物反應(yīng)器研究還相繼在豬、山羊等其它家畜上取得了成功。這一切表明利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人類藥用蛋白等生物活性物質(zhì)是可能和可行的。

以轉(zhuǎn)基因動物來生產(chǎn)目的產(chǎn)品，可極大地降低成本和投資風(fēng)險，而且還可以縮短新藥研制周期，如利用轉(zhuǎn)基因動物——乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)新藥一般需要5年，一般常規(guī)方法需要5—20年。第一百二十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器制造基因藥物也是一種可以獲取巨額利潤的新型產(chǎn)業(yè)。

如荷蘭金發(fā)馬公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，每年從乳汁中提煉出的營養(yǎng)奶粉的銷售額是50億美元。

英國羅斯林研究所研制成功的轉(zhuǎn)基因羊乳汁中含有α1-抗胰蛋白酶，它可以治療肺氣腫。

國外經(jīng)濟(jì)學(xué)家預(yù)測，10年后，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥物將會投放市場，從而使轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)成為具有高額利潤的新型產(chǎn)業(yè)。第一百二十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

在我國上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所與復(fù)旦大學(xué)遺傳所合作，于1996年成功研制出攜帶有人凝血因子Ⅸ基因的轉(zhuǎn)基因羊，其中1只產(chǎn)下的羊羔的乳汁中包含有人凝血因子Ⅸ蛋白，這種蛋白是治療血友病的珍貴藥物。利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物不會產(chǎn)生倫理上的問題，但是目前技術(shù)的難度還比較大，成功率也較低，產(chǎn)業(yè)化還需一定歷程第一百二十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一9．3．3．2動物血液生物反應(yīng)器及其他生物反應(yīng)器血液生物反應(yīng)器比較適合生產(chǎn)人血紅蛋白、抗體和生產(chǎn)非生物學(xué)活性的融合蛋白。這是由于有活性的蛋白或多肽(如激素、細(xì)胞分裂素、組織血纖維溶酶因子等)會進(jìn)入動物血液循環(huán)系統(tǒng)而影響動物的健康。

目前，已有多種通過轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的具有生物學(xué)功能的人血紅蛋白問世。第一百二十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

人血清白蛋白是人血漿中的主要成分，它是由585個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。在肝臟中合成后分泌進(jìn)入血液。臨床臨床上用于治療失血、創(chuàng)傷、癌癥等引起的休克、水腫等。

目前，醫(yī)用血清蛋白主要由人血提取，而有限的血液資源極大地限制了血清白蛋白的生產(chǎn)和使用。據(jù)統(tǒng)計，目前國內(nèi)白蛋白遠(yuǎn)不能滿足市場需要。英國科學(xué)家正在研究為人類提供血漿的動物。第一百三十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

通過分子生物技術(shù)重組能在豬肝臟中表達(dá)的人血清白蛋白融合基因，并以顯微注射的方法將融合基因注射到豬的受精卵中，培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因豬。從而實現(xiàn)在豬體內(nèi)合成人血清白蛋白的目的。第一百三十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

9．4．1存在問題轉(zhuǎn)基因動物制備是項復(fù)雜的工作，存在的許多問題需要進(jìn)一步的研究解決。除了轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身外，對于冷凍胚胎技術(shù)成活率低仍是一個主要問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問題主要體現(xiàn)在：9．4轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的問題與最新進(jìn)展第一百三十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(一)外源基因表達(dá)效率低和遺傳丟失目前，在轉(zhuǎn)基因動物研制中，外源基因與動物本身的基因組整合率低，如牛、羊和豬的整合率一般為1％左右，其表達(dá)往往不理想，外源基因應(yīng)有的性質(zhì)得不到充分表現(xiàn)或不表現(xiàn)、這種情況的原因可能是多方面的：第一百三十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(1)首先是目的基因的問題，不同的外源基因表達(dá)水平不相同，因每個個體而異。

(2)外源基因表達(dá)載體內(nèi)部各個部分的組合和連接是否合理等。(3)外源基因到達(dá)動物基因組內(nèi)整合的位置是否合理，人們還無法控制外源基因整合的位置，而只能是隨機(jī)整合。第一百三十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

對于大部分轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的表達(dá)低的解釋是轉(zhuǎn)基因受位置效應(yīng)的影響。

近年來對此現(xiàn)象一種新的解釋是：外源基因的不表達(dá)是由于多拷貝重復(fù)序列導(dǎo)致了該區(qū)域異染色質(zhì)化，從而使轉(zhuǎn)基因沉默。

并認(rèn)為這種沉默是真核生物基因組受到其他序列的威脅時出現(xiàn)的一種保護(hù)機(jī)制。這些解釋是否合理有待于今后研究的證實。第一百三十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

（二）轉(zhuǎn)基因技術(shù)尚不成熟以上這些問題除了理論原因尚不太清楚外、另外一個主要原因來自于轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身的不成熟。

目前用于轉(zhuǎn)基因動物制備的方法主要有顯微注射法、ES細(xì)胞法、病毒載體法、精子載體法等，其中精子載體法還剛剛起步，對其重復(fù)性還有爭議。而病毒載體法由于安全性等問題而難以推廣。第一百三十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

原核顯微注射法被公認(rèn)為應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)基因制備技術(shù)，但是它需要昂貴的設(shè)備、再者，存在易損傷受精卵而效率低下、外源DNA整合進(jìn)受體基因組的機(jī)會很小(在時間和位置上基本都是隨機(jī)的)等不足。

盡管ES細(xì)胞傳代穩(wěn)定，體外操作性強(qiáng)，適用于多種方法導(dǎo)入外源基因。而且允許在體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因整合的篩選和鑒定，是現(xiàn)有技術(shù)中最有前途的一種。但是ES細(xì)胞建系非常困難，目前僅有小鼠的ES細(xì)胞建系方法比較成熟，而對于大型動物如家畜尚未成功，這是影響ES細(xì)胞法進(jìn)一步應(yīng)用的主要障礙。第一百三十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(三)轉(zhuǎn)基因動物成活率低及其后遺癥轉(zhuǎn)基因動物出生后部分個體易表現(xiàn)出各種生理和免疫缺陷，此外轉(zhuǎn)基因動物也存在許多后遺癥。

如轉(zhuǎn)生長激素基因的轉(zhuǎn)基因動物的死胎和畸形率高，患關(guān)節(jié)炎、胃潰瘍、腎病和生殖能力喪失等疾病的較為普遍，這可能與基因進(jìn)入受體后同受體染色體組隨機(jī)整合及GH表達(dá)水平失控有關(guān)第一百三十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(四)難以控制轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為

現(xiàn)有的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍無法實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的定點整合，轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的插入是隨機(jī)的。轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的隨機(jī)插入可能導(dǎo)致內(nèi)源基因的破壞或失活，也可能激活某些正常狀態(tài)下關(guān)閉的基因，結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因陽性個體出現(xiàn)不育、胚胎死亡和畸形等不良現(xiàn)象。

第一百三十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(五)無法控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)頻率和水平

多數(shù)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)烈地受著其在宿主染色體上整合位點的影響，即存在著所謂的位置效應(yīng)(position

effect)，相鄰基因或異染色質(zhì)區(qū)域影響著外源基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致同樣的基因在不同的轉(zhuǎn)基因個體表達(dá)的水平很不一致，大部分轉(zhuǎn)基因(尤其是cDNA)的表達(dá)水平低得難以檢測，而個別個體轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平卻又太高，使宿主動物難以承受。

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(六)轉(zhuǎn)基因動物模型可能與預(yù)期不符

在鐮刀狀貧血動物模型研究中，人們試圖將突變的血紅蛋白的基因轉(zhuǎn)入小鼠以獲得鐮刀狀貧血動物，但結(jié)果使研究者大失所望，所有的轉(zhuǎn)基因動物都只表現(xiàn)出鐮刀狀紅細(xì)胞的病變而未發(fā)現(xiàn)貧血

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（七）轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器產(chǎn)品的安全性問題這包括轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的產(chǎn)物的分離和提純、表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物活性鑒定與人體蛋白的相似性等問題。只有從表達(dá)產(chǎn)物中除去能引起人類不良反應(yīng)的非人類蛋白，保證產(chǎn)品具有與人體足夠的相似性，才能應(yīng)用于人類的健康事業(yè)。第一百四十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

(八)傳統(tǒng)觀念與倫理的挑戰(zhàn)盡管轉(zhuǎn)基因動物還有一些技術(shù)問題亟待解決，但是轉(zhuǎn)基因動物研究所取得的巨大進(jìn)展，特別是它在各個領(lǐng)域中的廣