中藥色譜分析色譜聯(lián)用技術(shù)2

液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)質(zhì)量過(guò)濾器當(dāng)前第1頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)API

電離源LC/MS-

WatersAllianceZMD系統(tǒng)

當(dāng)前第2頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)Agilent1100SeriesLC/MSD當(dāng)前第3頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)Varian1200LLC/MS&LC/MS/MSProStarBinary210SolventDeliverySystemProStar430AutoSamplerModule1200LLC/MS當(dāng)前第4頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)1200LLC/MS/MSAnalyzerSprayChamberDiverterCapillaryPlug&HexapoleIonGuideQ1Q2Curved185mmPathQ3Multiplier+/-5kVpostaccelerationDualStageTurbo當(dāng)前第5頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)？？LC與MS聯(lián)用面臨的問(wèn)題？？將常規(guī)LC每分鐘約1ml或數(shù)ml流速的液體流動(dòng)相引入要求高真空操作的MS儀，引起流速不協(xié)調(diào);經(jīng)典離子化方法的高溫高電壓不適合LC分析的熱不穩(wěn)定性或難揮發(fā)性樣品的離子化;

LC分析常用的難揮發(fā)性緩沖鹽系統(tǒng)易污染MS儀當(dāng)前第6頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LC/MS聯(lián)用的接口技術(shù)*直接液體導(dǎo)入接口(DirectLiquidIntroduction)*傳送帶技術(shù)(MovingBeltInterface)流出物滴落在傳送帶上，紅外線加熱去溶劑缺點(diǎn)：離子化效率低；記憶效應(yīng)*熱噴霧(Thermospray)流動(dòng)相經(jīng)過(guò)噴霧探針時(shí)被加熱，體積膨脹后以超聲速噴出形成霧滴，離子蒸發(fā)；流速1ml/min，水相多缺點(diǎn)：MW200-1000u；熱分解當(dāng)前第7頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LC/MS：ESI結(jié)構(gòu)圖當(dāng)前第8頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)FinniganESI當(dāng)前第9頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)AgilentESI當(dāng)前第10頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ABESI當(dāng)前第11頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)WatersESI當(dāng)前第12頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)VarianESISprayChamberCapillaryPlug&HexapoleIonGuide

SampleSprayAssembly當(dāng)前第13頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ElectrosprayIonization,desolvation,

excessdropletremovalN2GasHeaterN2dryinggasVacuumRestrictionDryinggaspromotesrapiddesolvationandblowslargedropletsawayfromcapillaryinletIonsDropletsDropletsDroplets當(dāng)前第14頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ElectrosprayMechanism++++++++++++++++DesolvationNeedleChargedDropletAnalyteIonization當(dāng)前第15頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LC-MSionization當(dāng)前第16頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LC-MSionization++++++++++HotDryingGas++++++++++solventsolventsolventsolvent當(dāng)前第17頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LC-MSionization當(dāng)前第18頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LC-MSionization當(dāng)前第19頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LiquidNebulizingGasOptimumdependsonliquidflowInnertoouterneedlepositioniscriticaltonebulizationefficiency當(dāng)前第20頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)液滴分布狀態(tài)LargeunchargeddropletsSmallhighlychargeddropletsIntermediatesizedropletsSprayneedleTaylorconeSpreadingduetochargerepulsion當(dāng)前第21頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ElectrosprayIonization,desolvation,

excessdropletremovalN2GasHeaterN2dryinggasVacuumRestrictionDryinggaspromotesrapiddesolvationandblowslargedropletsawayfromcapillaryinletIonsDropletsDropletsDroplets當(dāng)前第22頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)進(jìn)入四級(jí)桿質(zhì)量分析器3.5mTorr0.8TorrDropletsIonsQ1Dropletdesolvationoccursbeforeentrancetothecapillary.Ion/Solventclustersaredissociatedbycollisionsbeforetheskimmerconeandintheionguide.IonsSmallIons

IonGuide當(dāng)前第23頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)分析物離子化AnalyteformsanioninthemobilephasePositiveIonESICationattachment:H++M(M+H)+

alsoNa+,K+,NH4+NegativeIonESIProtonloss:M(M-H)-+H+Anionattachment:A-+M(M+A)-

當(dāng)前第24頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)示例：穩(wěn)定母離子的確認(rèn)定量離子對(duì)：多烯紫杉醇m/z830→549.0（[TNa]+，圖A）紫杉醇

m/z876→591.0（[TNa]+，圖B）

當(dāng)前第25頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)不同甲酸濃度下多西他賽母離子的穩(wěn)定性與靈敏度考察加鈉離子（m/z830）2.加鉀離子（m/z846）3.加氫離子（m/z808）0‰formicacid0.05‰formicacid0.1‰formicacid0.2‰formicacid當(dāng)前第26頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)不同甲酸濃度下多西他賽子離子的穩(wěn)定性與靈敏度考察0‰formicacid0.05‰formicacid0.1‰formicacid0.2‰formicacid1.加鈉離子（m/z549）2.加鉀離子（m/z565）3.加氫離子（m/z527）當(dāng)前第27頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LC/MS：APCI結(jié)構(gòu)圖當(dāng)前第28頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)APCI:Nebulization&VaporizationAPCIisagasphasereactionAnalytemustbeavailableasastable,gasphasemoleculeMatrixcomponentsmayormaynotundergonon-destructiveevaporationEvaporationdrivenbyaveryhotauxiliarygasliquidgasQuartzTubeQuartzTubeVortexflowofhotgasgas當(dāng)前第29頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)IonizationintheAPCIChamberCoronaNeedleCIreactionsoccurbetweenthecoronaneedleandthesprayplateNebulizerandauxiliarygasplusgasphasemoleculesofmobilephase,analyteandmatrixfloodintotheAPCIchamber當(dāng)前第30頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)APCI基本原理從液相色譜流出的樣品溶液進(jìn)入一具有霧化氣套管的毛細(xì)管，經(jīng)氮?dú)饬黛F化，通過(guò)加熱管時(shí)被氣化。在加熱管端進(jìn)行電暈尖端放電．溶劑分子被電離，充當(dāng)反應(yīng)氣，與樣品氣態(tài)分子碰撞，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程，樣品分子生成準(zhǔn)分子離子：

R+eR+·+2eRH++MMH++R當(dāng)前第31頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ESIAPCI對(duì)象中等至強(qiáng)極性分子非極性/中等極性不適宜極端非極性樣品熱穩(wěn)定性差/非揮發(fā)性流動(dòng)相

pH對(duì)離子化效率影響較大緩沖鹽濃度低緩沖鹽濃度可高些有機(jī)相比例不能太低水相比例可高些流速低流速較好高流速比ESI好

當(dāng)前第32頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LCLC/MS：*多數(shù)色譜柱與LC/MS匹配，離子交換柱除外*使用有機(jī)溶劑比例較高的系統(tǒng)*避免使用難揮發(fā)性緩沖鹽，可用醋酸銨、甲酸銨、三氟乙酸；*使用揮發(fā)性離子對(duì)試劑：氫氧化四丁基銨（TBAH），七氟丁酸（HFBA）*流量匹配：兼顧色譜分離效果和ESI離子化效率；用1-2mm內(nèi)徑色譜柱，300-500ul/min；柱后分流當(dāng)前第33頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ScanModes–FullScan全掃描MSModeQ1Q2Q3Fullscan(Q1)Fullscan(Q3)=scanned;=selectedm/z;blank=completetransmission當(dāng)前第34頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ScanModes–SIM選擇離子監(jiān)測(cè)MSModeQ1Q2Q3Selectedionmonitoring(SIM)(Q1)Selectedionmonitoring(SIM)(Q3)=scanned;=selectedm/z;blank=completetransmissionSelectedIonMonitoring當(dāng)前第35頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ScanModes–SRM選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)MSModeQ1Q2Q3Selectedreactionmonitoring(SRM)Selectedreactionmonitoring(SRM)=scanned;=selectedm/z;=CIDCollisioninduceddissociationSelectedReactionMonitoring當(dāng)前第36頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ScanModes–MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MSModeQ1Q2Q3Multiplereactionmonitoring(MRM)Multiplereactionmonitoring(MRM)=scanned;=selectedm/z;=CIDMultipleReactionMonitoring當(dāng)前第37頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)當(dāng)前第38頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ScanModes–PrecursorScan母離子掃描MSModeQ1Q2Q3PrecursorScanMS/MS=scanned;=selectedm/z;=CID當(dāng)前第39頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ScanModes–ProductScan子離子掃描MSModeQ1Q2Q3ProductScanMS/MS=scanned;=selectedm/z;=CID當(dāng)前第40頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ScanModes–NeutralLossScan

中性丟失掃描MSModeQ1Q2Q3PrecursorScanMS/MS=scanned;=scannedwithoffset;=CID當(dāng)前第41頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)多種掃描模式設(shè)定Allmodesaretimeprogrammable,withnumeroustimesegmentsavailableforeachmethodFullScanSIMSRMMRMPrecursorScanNeutralLoss當(dāng)前第42頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)Scan:250-500當(dāng)前第43頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)521ESI(-)523ESI(+)當(dāng)前第44頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)XIC521XIC523當(dāng)前第45頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)ProductScanProductScan:523→100~523361當(dāng)前第46頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)NeutralLossScan:400~550→238~388野鳶尾苷當(dāng)前第47頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)LC/MS在中藥研究中的應(yīng)用中藥化學(xué)成分的快速篩選及成分分析質(zhì)譜檢測(cè)器可以給出大量的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合同類已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，或結(jié)合其它檢測(cè)方法，即可對(duì)未知成分進(jìn)行直接分析，因此在以生物活性為指導(dǎo)的化學(xué)篩選中，可以對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行靶分析中藥質(zhì)量控制--中藥指紋圖譜研究LC-MS聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用彌補(bǔ)了紫外檢測(cè)的不足，還提供了大量的化學(xué)成分信息，可實(shí)現(xiàn)對(duì)各主要流出組分的定性，從而為藥材及其制劑的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更加全面、可靠的依據(jù)當(dāng)前第48頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)IdentificationofmultiplecomponentsinGuanxinninginjectionusinghydrophilicinteractionliquidchromatography/time-of-flightmassspectrometryandreversephaseliquidchromatography/time-of-flightmassspectrometryRapidCommunicationsinMassSpectrometryXiaofeiChen,ZiyangLou,HaiZhang,GuangguoTan,ZhiruiLiu,WuhongLi,ZhenyuZhuandYifengChai*示例：應(yīng)用親水作用色譜-反相色譜互補(bǔ)策略聯(lián)用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器鑒別冠心寧注射液的主要成分當(dāng)前第49頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)研究背景2009年7月，SFDA針對(duì)近年來(lái)中藥注射劑頻發(fā)質(zhì)量安全事故這一問(wèn)題，下發(fā)了《關(guān)于開(kāi)展中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)工作的通知》，要求在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)展中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)工作，并提出了如下要求：

全面開(kāi)展生產(chǎn)及質(zhì)量控制環(huán)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)排查，切實(shí)控制中藥注射劑安全隱患

因此，將注射液中絕大多數(shù)甚至全部成分搞清楚是，并進(jìn)行針對(duì)性的質(zhì)量控制，是保證中藥注射液安全穩(wěn)定的基礎(chǔ)。當(dāng)前第50頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)研究背景冠心寧注射液：收載于衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)（1998）由丹參和川芎兩味傳統(tǒng)中藥組成；臨床上主要用于冠心病、心絞痛、腦栓塞等心、腦血管疾病的治療；具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)，加速缺血心肌的修復(fù)等作用；注射液中主要成分為酚酸類、苯酞類等水溶性成分，——這是通常認(rèn)為的起作用成分當(dāng)前第51頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)糖、氨基酸、有機(jī)酸等成分同樣也起到一定的作用，輔料的含量也應(yīng)得到控制，但由于這些物質(zhì)極性均較強(qiáng)，很難在常規(guī)的C18柱上表征。當(dāng)前第52頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)色譜條件：RPLC分離使用AgilentZorbaxSB-C18柱(100mm×3.0mmI.D.,3.5μm)，柱溫30℃，流動(dòng)相使用0.4%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫0-19min，2-23%B；19-27min，23-30%B；27-35min，30-90%B；35-45min，90%B。流速0.5mL/min，為了獲得更好的電噴霧效率，柱后分流保持0.2mL/min進(jìn)入質(zhì)譜分析，進(jìn)樣量為5μL。HILIC分離使用SHISEIDOPCHILIC柱(150mm×2.0mmI.D.,5μm)，柱溫40℃，流動(dòng)相使用5mmoL/L醋酸銨水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫0-10，90%B；10-20min，90-70%B；20-25min，70%B。流速0.2mL/min，直接進(jìn)入質(zhì)譜分析，進(jìn)樣量為2μL。當(dāng)前第53頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)質(zhì)譜條件：

檢測(cè)器為Agilent6200TOF/MS裝配ESI離子源。TOF/MS分析使用全掃描模式，質(zhì)核比范圍100-1100，負(fù)離子模式。ESI離子源條件如下：干燥氣流速，8L/min；干燥氣溫度，350℃；霧化器壓力，35psig；毛細(xì)管壓力，4000V；碎片電壓，130-325V動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)；skimmervoltage,60V;octopoleRF,250V。當(dāng)前第54頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)化合物鑒別策略樣品處理1、與對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間、碎片信息與已知碎片骨架信息比對(duì)LC-TOF/MS分析,獲得色譜峰精確分子量2、在化合物數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索匹配化合物數(shù)據(jù)庫(kù)建立對(duì)照品處理3、根據(jù)碎片信息推導(dǎo)可能的結(jié)構(gòu)比對(duì)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，嘗試鑒別非目標(biāo)化合物，個(gè)別購(gòu)買對(duì)照品確證誤差<5ppm，利用[M–H]-、[2M–H]-[M–2H+Na]-等分子離子峰信息匹配最有可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)式通過(guò)查詢注射液藥材相關(guān)的植物化學(xué)和藥理學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)獲得，數(shù)據(jù)庫(kù)包括化合物的化學(xué)式、精確分子量、名稱、中文名、來(lái)源植物，CAS號(hào)，紫外信息，質(zhì)譜信息，參考文獻(xiàn)和注釋。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，明確鑒別目標(biāo)化合物目標(biāo)化合物非目標(biāo)化合物當(dāng)前第55頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)C18柱TOFMS總離子流圖HILIC柱TOFMS總離子流圖34個(gè)化合物，4組同分異構(gòu)體17個(gè)化合物，1組同分異構(gòu)體56當(dāng)前第56頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)非目標(biāo)化合物的鑒別和確證EIC:m/z=130.0609碎片電壓130V128.0351的同位素分布離子12&1、異亮氨酸2、亮氨酸C6H13NO257當(dāng)前第57頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)C12H22O11非目標(biāo)化合物的鑒別和確證[2M-H]—[M+HCOO]—[M-H]—[M-H]—[2M-H]—-162[Glucose-H]—蔗糖58當(dāng)前第58頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)非目標(biāo)化合物的鑒別和確證[2M-2H+Na]—[M-H]—[M-H-NH2]—L-苯丙氨酸C9H11NO259當(dāng)前第59頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)示例：LC-DAD-MS/MS分離鑒定中藥蓮子心中三種生物堿蓮子心中主要有效成分－雙芐基異喹啉類生物堿的藥用價(jià)值日趨重視。其中，蓮心堿（Ⅰ）、異蓮心堿（Ⅱ）、甲基蓮心堿（Ⅲ）為蓮子心中雙芐基異喹啉類生物堿的主要成分JPharmBiomedAnal.43(2007)99-104.IF20072.761當(dāng)前第60頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期六\21點(diǎn)DriedandpowderedembryooftheseedofN.nuciferaGAERTN.(10kg)wassoakedin1%HClfor1week.Thefiltratewasthenprecipitatedwith10%aquaammoniauntilthepHofthesolutionreached8.5and593gofcrudeextractwerecollectedasbrownprecipitates.Thecrudeextractwasextractedthreetimeswithchloroform,andthentheorganicphasewasextractedtwotimeswith3%NaOH.Finally,theextractsolutionwasprecipitatedwithdilutedHClandoff-whiteprecipitateswerefilteredanddriedtoobtainphenolicalkaloidsample(38.5g).Theprimarystocksolutionsofcrudeextract(1mg/ml)andphenolicalkaloidsample(1mg/ml)werepreparedbydissolvinga