辣椒開(kāi)放式花藥培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

DB43/TXXXX—2022辣椒開(kāi)放式花藥培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了辣椒開(kāi)放式花藥培養(yǎng)的術(shù)語(yǔ)與定義、試劑和設(shè)備、培養(yǎng)基的配制、花藥培養(yǎng)技術(shù)操作規(guī)程。本文件適用于辣椒花藥開(kāi)放式培養(yǎng)技術(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB43/T985-2015辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)與定義適用于本文件。3.1花藥開(kāi)放式培養(yǎng)指通過(guò)往培養(yǎng)基中添加抗生素，能在室內(nèi)條件下，剝?nèi)±苯冯x體花蕾中花藥，并將花藥接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的一種組織培養(yǎng)方式。3.2胚狀體指辣椒花藥離體培養(yǎng)過(guò)程中，花藥中小孢子經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和發(fā)育過(guò)程，形成與合子胚相似的結(jié)構(gòu)。胚狀體進(jìn)一步培養(yǎng)可形成完整植株。3.3單倍體植株由辣椒花藥中小孢子發(fā)育獲得的，具有配子染色體的再生植株。3.4雙單倍體植株對(duì)辣椒單倍體植株生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行秋水仙素加倍處理后獲得的二倍體植株。4試劑和設(shè)備4.1試劑所有試劑等級(jí)均為分析純，見(jiàn)表1。表1辣椒開(kāi)放式花藥培養(yǎng)所需試劑試劑名稱無(wú)機(jī)試劑次氯酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硝酸銨、硝酸鉀、氯化鈣、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碘化鉀、硼酸、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、鉬酸鈉、氯化鈷、硫酸亞鐵、EDTA二鈉鹽有機(jī)試劑酒精、肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸、葉酸、生物素、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑a-萘乙酸、激動(dòng)素抗生素百菌清、鏈霉素其他X脂粉、蔗糖、活性炭4.2儀器設(shè)備超純水儀、電子分析天平（精確度：0.0001g）、pH計(jì)（或pH試紙）、刻度容量瓶（量程100mL、500mL）、移液槍（量程分別為100μL、1mL、10mL）、低溫冷藏冰箱（溫度范圍：0～10℃）、高壓蒸汽滅菌鍋。培養(yǎng)基的配制5.1培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基包括胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、幼苗分化培養(yǎng)基兩種，其配方見(jiàn)附錄A。5.2消毒培養(yǎng)基配制后調(diào)pH值為5.8～6.0，然后置于高壓滅菌鍋中121℃，1.05kg/cm2條件下滅菌15min。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及抗生素在培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌，冷卻至60℃左右再加入。6培養(yǎng)前準(zhǔn)備6.1花蕾采集和低溫預(yù)處理于現(xiàn)蕾期，選擇生長(zhǎng)勢(shì)好、無(wú)病蟲(chóng)害的辣椒植株，采集花萼與花瓣齊平或花萼微露出花瓣的花蕾（此階段小孢子處于單核靠邊期，易誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生），放入自封口袋或離心管中，置于冰箱中4℃低溫預(yù)處理48h。6.2花蕾消毒取花蕾，左手捏住花蕾底部花柄，右手用尖頭鑷子繞離花蕾頂端約3/4處輕輕劃圈，剝?nèi)セɡ夙敳康幕ㄝ?，露出青綠色花瓣。將花蕾置于5%（V/V）的次氯酸鈉溶液中消毒10min，棄次氯酸鈉溶液，無(wú)菌水沖洗2～3遍，用鑷子將花蕾夾入墊有雙層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干花蕾表面水分，用于花藥接種。6.3花藥接種選擇普通實(shí)驗(yàn)室作為接種室，接種前先用紫外線燈照射房間30min，75%酒精擦拭雙手和試驗(yàn)臺(tái)面。取鑷子，置于酒精燈火焰外焰上來(lái)回移動(dòng)，灼燒鑷子30s左右。待鑷子冷卻后，用尖端微微挑開(kāi)花瓣，再徒手輕輕擠壓花瓣，使花藥自然脫落于培養(yǎng)基表面。接種后蓋好培養(yǎng)皿蓋子，用封口膜將培養(yǎng)皿封口，在培養(yǎng)皿蓋上用記號(hào)筆注明接種花藥的辣椒品種名稱和接種日期。由于采用的培養(yǎng)方式為開(kāi)放式培養(yǎng)，為防止微生物侵染，花藥接種后每隔15d時(shí)須轉(zhuǎn)接至新配制的同成分培養(yǎng)基上培養(yǎng)。7花藥培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中，35℃黑暗條件下培養(yǎng)8d，之后再將溫度調(diào)至25℃繼續(xù)黑暗培養(yǎng)，直至有白色胚狀體產(chǎn)生。培養(yǎng)過(guò)程中不定時(shí)觀察培養(yǎng)皿中花藥染菌情況，如發(fā)現(xiàn)有染菌的花藥，立即取出該培養(yǎng)皿，用灼燒后冷卻的鑷子將未染菌的花藥取出，接種于新的培養(yǎng)基表面。8胚狀體分化成苗取出花藥，用無(wú)菌鑷子輕輕剝離白色胚狀體，轉(zhuǎn)接至無(wú)激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)至分化成苗。此階段培養(yǎng)條件為：有光照時(shí)溫度為25±0.5℃，無(wú)光照時(shí)溫度為20±0.5℃，光照強(qiáng)度為3000lx，光照時(shí)間為16h/d。9再生苗煉苗與移栽將生長(zhǎng)至6葉期的再生苗從培養(yǎng)基中取出，用約20℃的清水輕輕清洗幼苗根部，去除根部培養(yǎng)基。將幼苗移入經(jīng)180℃高溫消毒1h的基質(zhì)（基質(zhì)中蛭石、珍珠巖和草炭體積比為6:3:2）中，遮陰、保濕，促進(jìn)緩苗。植株度過(guò)緩苗期后，將苗室的環(huán)境條件逐步調(diào)整到室外條件進(jìn)行煉苗，15d后將幼苗移栽至大棚中。10染色體加倍配制0.25%的秋水仙堿溶液，避光保存。用脫脂棉包裹花培植株側(cè)枝生長(zhǎng)點(diǎn)，每天下午6:00-7:00往脫脂棉上滴加秋水仙素溶液，連續(xù)處理3d，將脫脂棉取下，用蒸餾水沖洗生長(zhǎng)點(diǎn)，加倍成功側(cè)枝可收獲帶種子的果實(shí)，收集種子，播種后植株為雙單倍體植株。

附錄A

（辣椒開(kāi)放式花藥培養(yǎng)培養(yǎng)基配方成分）培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基配方成分胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基720mg/L硝酸銨、950mg/L硝酸鉀、166mg/L氯化鈣、185/Lmg七水硫酸鎂、68mg/L磷酸二氫鉀、10mg/L硼酸、25mg/L四水硫酸錳、10mg/L七水硫酸鋅、0.25mg/L三氧化鉬、0.025mg/L硫酸銅、0.025/Lmg氯化鈷、27.8mg/L硫酸亞鐵、37.8mg/LEDTA二鈉鹽、100mg/L肌醇、5mg/L煙酸、0.5mg/L鹽酸吡哆醇、0.5mg/L鹽酸硫胺素、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L葉酸、0.05mg/L生物素、0.5mg/L核糖核酸酵母、0.8g/L谷氨酰胺、0.3g/L絲氨酸、0.1mg脯氨酸、0.25mg/La-萘乙酸、1.00mg/L激動(dòng)素、0.5g/L硝酸銀、0.03g/L秋水仙堿、6g/LX脂粉、2.5g/L活性炭、30g/L蔗糖、500mg/L百菌清、25mg/L鏈霉素胚狀體成苗培養(yǎng)基1650mg/L硝酸銨、1900mg/L硝酸鉀、440mg/L氯化鈣、370mg/L七水硫酸鎂、170mg/L磷酸二氫鉀、0.83mg/L碘化鉀、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L四水硫酸錳、8.6mg/L七水硫酸鋅、0.25mg/L鉬酸鈉、0.025mg/L硫