動(dòng)物性食品衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定一、目的與要求1、學(xué)習(xí)掌握菌落總數(shù)測(cè)定的基本原理和方法；2、了解動(dòng)物性食品上微生物的分布和繁殖動(dòng)態(tài)。

當(dāng)前第1頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定二、實(shí)驗(yàn)說明

菌落總數(shù)（aerobicplatecount）是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。

菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)用不同的營(yíng)養(yǎng)條件及其他生理?xiàng)l件（如溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等）去滿足其要求才能將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。但在實(shí)際工作中，一般都只用一種常用的方法去做。細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定，所得結(jié)果，只包括一群能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數(shù)。當(dāng)前第2頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定三、檢驗(yàn)程序檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)

10倍系列稀釋選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)每皿中加入15mL～20mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻培養(yǎng)

計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù)

報(bào)告

計(jì)算菌落總數(shù)當(dāng)前第3頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定四、操作步驟（一）樣品稀釋1、固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000~10000r/min均質(zhì)1~2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2min，制成1:10的樣品勻液。2、液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。當(dāng)前第4頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定四、操作步驟（一）樣品稀釋3、用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。4、按3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。當(dāng)前第5頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定四、操作步驟（一）樣品稀釋5、根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。6、及時(shí)將15~20mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。當(dāng)前第6頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定四、操作步驟（二）培養(yǎng)1、待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36±1℃培養(yǎng)48±2h。水產(chǎn)品30±1℃培養(yǎng)72±3h。2、如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按1條件進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)前第7頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定四、操作步驟（三）菌落計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits，CFU）表示。1、選取菌落數(shù)在30~300CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。2、其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。3、當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。當(dāng)前第8頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)當(dāng)前第9頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定五、結(jié)果與報(bào)告（一）菌落總數(shù)的計(jì)算方法1、若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。2、若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算：當(dāng)前第10頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定五、結(jié)果與報(bào)告（一）菌落總數(shù)的計(jì)算方法N=∑C/（n1+0.1n2）d式中：N——樣品中菌落數(shù)；∑C——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。當(dāng)前第11頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定五、結(jié)果與報(bào)告（一）菌落總數(shù)的計(jì)算方法稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）菌落數(shù)（CFU）232，24433，35N=∑C/（n1+0.1n2）d=（232+244+33+35）/【2+（0.1×2）】×10-2

=544/0.022=24727當(dāng)前第12頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定五、結(jié)果與報(bào)告（一）菌落總數(shù)的計(jì)算方法3、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。4、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。5、若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。6、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30~300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

當(dāng)前第13頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一、菌落總數(shù)測(cè)定五、結(jié)果與報(bào)告（二）菌落總數(shù)的報(bào)告1、菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。2、菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。3、若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。4、若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。5、稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。

當(dāng)前第14頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)動(dòng)物性食品衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)當(dāng)前第15頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)一、目的與要求1、學(xué)習(xí)掌握大腸菌群計(jì)數(shù)的基本原理和方法；2、了解動(dòng)物性食品的衛(wèi)生狀態(tài)。

當(dāng)前第16頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)說明

大腸菌群(coliforms)是指在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法當(dāng)前第17頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)三、檢驗(yàn)程序——第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)

10倍系列稀釋選擇適宜3個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管不產(chǎn)氣產(chǎn)氣BGLB肉湯36℃±1℃48h±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陽(yáng)性36℃±1℃48h±2h查MPN表

報(bào)告結(jié)果

大腸菌群陰性當(dāng)前第18頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯成分：胰蛋白胨或胰酪胨氯化鈉乳糖磷酸氫二鉀（K2HPO4）磷酸二氫鉀（KH2PO4）月桂基硫酸鈉蒸餾水煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯

成分：蛋白胨乳糖牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液0.1%煌綠水溶液蒸餾水當(dāng)前第19頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)三、檢驗(yàn)程序——第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)

10倍系列稀釋選擇2-3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種VRBA平板計(jì)數(shù)典型和可疑菌落BGLB肉湯36℃±1℃48h±2h報(bào)告結(jié)果48h±2h36℃±1℃當(dāng)前第20頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）成分：蛋白胨酵母膏乳糖氯化鈉膽鹽或3號(hào)膽鹽中性紅結(jié)晶紫瓊脂蒸餾水當(dāng)前第21頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（一）樣品的稀釋

1、固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000~10000r/min均質(zhì)1~2min，或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2min，制成1:10的樣品勻液。2、液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。當(dāng)前第22頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（一）樣品的稀釋

3、樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。4、用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

當(dāng)前第23頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（一）樣品的稀釋

5、根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。

當(dāng)前第24頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（二）初發(fā)酵試驗(yàn)

每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。當(dāng)前第25頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（三）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)

用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。當(dāng)前第26頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（四）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告按（三）確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN表，報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。當(dāng)前第27頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（一）樣品的稀釋

按第一法進(jìn)行。當(dāng)前第28頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（二）平板計(jì)數(shù)

1、選取2～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。2、及時(shí)將15～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36±1℃培養(yǎng)18～24h。當(dāng)前第29頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（三）平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15～150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。當(dāng)前第30頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（三）證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。

當(dāng)前第31頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)二、大腸菌群計(jì)數(shù)（四）大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以（三）中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4

樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。當(dāng)前第32頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)動(dòng)物性食品衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第33頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)一、目的與要求1、學(xué)習(xí)掌握沙門氏菌檢驗(yàn)的基本原理和方法；2、了解動(dòng)物性食品檢驗(yàn)沙門氏菌的意義。

當(dāng)前第34頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)說明

沙門氏菌（Salmonella）是一群形態(tài)和培養(yǎng)特性都類似的腸桿菌科中的一個(gè)大屬，也是腸桿菌科中最重要的病原菌屬。沙門氏菌均有致病性。根據(jù)對(duì)宿主適應(yīng)性不同，沙門氏菌分為三群：第一群具有高度適應(yīng)性，只對(duì)人或某種動(dòng)物致??；第二群在一定程度適應(yīng)于特定動(dòng)物；第三群非適應(yīng)性，廣泛感染的宿主譜，能引起人和各種動(dòng)物的沙門氏菌病，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，占本屬的大多數(shù)。

沙門氏菌的血清型表示方法是O抗原：第1相抗原：第2相抗原當(dāng)前第35頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)三、檢驗(yàn)程序225g（mL）檢樣+225mLBPW36±1℃8±18hBSXLD（或HE、顯色培養(yǎng)基）1mL+SC10mL36±1℃18±24h1mL+TTB10mL42±1℃18±24h挑取可疑菌落36±1℃18±24h36±1℃40±48hTSI，賴氨酸，靛基質(zhì)，尿素(pH7.2)，KCN

生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)+

H2S+靛基質(zhì)-尿素-KCN-賴氨酸+H2S+靛基質(zhì)+尿素-KCN-賴氨酸+H2S-靛基質(zhì)-尿素-KCN-賴氨酸+/-

反應(yīng)結(jié)果與左側(cè)描述不符當(dāng)前第36頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)三、檢驗(yàn)程序甘露醇+、山梨醇+

ONPG-

非沙門氏菌沙門氏菌，血清學(xué)試驗(yàn)報(bào)告當(dāng)前第37頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)BPW：緩沖蛋白胨水TTB：四硫磺酸鈉煌綠增菌液SC：亞硒酸鹽胱氨酸增菌液BS：亞硫酸鉍瓊脂XLD：木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂TSI：三糖鐵瓊脂KCN：氰化鉀培養(yǎng)基ONPG：鄰硝基酚β-D半乳糖苷培養(yǎng)基當(dāng)前第38頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（一）前增菌稱取25g（mL）樣品放入盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000～10000r/min均質(zhì)1～2min，或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測(cè)定pH值，用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36±1℃培養(yǎng)8～18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15min，或2～5℃不超過18h解凍。

當(dāng)前第39頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（二）增菌輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

當(dāng)前第40頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（三）分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。當(dāng)前第41頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)BS瓊脂：菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。當(dāng)前第42頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)XLD瓊脂：菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。當(dāng)前第43頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)HE瓊脂：藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。當(dāng)前第44頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)沙門氏菌顯色培養(yǎng)基：當(dāng)前第45頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（四）生化試驗(yàn)1、自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h。當(dāng)前第46頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫KA＋（－）＋（－）＋可疑沙門氏菌屬KA＋（－）＋（－）－可疑沙門氏菌屬AA＋（－）＋（－）＋可疑沙門氏菌屬AA＋/－＋/－－非沙門氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙門氏菌注：K：產(chǎn)堿，A：產(chǎn)酸；＋：陽(yáng)性，－：陰性；＋（－）：多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性；＋/－：陽(yáng)性或陰性。沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果當(dāng)前第47頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。當(dāng)前第48頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（四）生化試驗(yàn)2、接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)，可直接接種蛋白胨水供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h，按沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表（1）判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時(shí)復(fù)查。當(dāng)前第49頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)反應(yīng)序號(hào)硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶A1＋－－－＋A2

＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋陽(yáng)性；－陰性；＋/－陽(yáng)性或陰性。沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表（1）當(dāng)前第50頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（四）生化試驗(yàn)2.1

反應(yīng)序號(hào)A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表（2）可判定為沙門氏菌。如有2項(xiàng)異常為非沙門氏菌。

當(dāng)前第51頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果－－－甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙門氏菌個(gè)別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）注：＋表示陽(yáng)性；＋表示陰性。

沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表（2）當(dāng)前第52頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（四）生化試驗(yàn)2.2反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。

當(dāng)前第53頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（四）生化試驗(yàn)2.3反應(yīng)序號(hào)A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。當(dāng)前第54頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（四）生化試驗(yàn)2.4

必要時(shí)按沙門氏菌屬各生化群的鑒別進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。當(dāng)前第55頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)項(xiàng)目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇＋＋－－＋－山梨醇＋＋＋＋＋－水楊苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸鹽－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋表示陽(yáng)性;－表示陰性。

沙門氏菌屬各生化群的鑒別當(dāng)前第56頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（四）生化試驗(yàn)3、如選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)1的初步判斷結(jié)果，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙海褂蒙b定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

當(dāng)前第57頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)法國(guó)生物梅里埃ATB自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀微生物鑒定用試劑盒美國(guó)BILOG公司ELX808BLG自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀當(dāng)前第58頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（五）血清學(xué)鑒定1、抗原的準(zhǔn)備

一般采用1.2％～1.5％瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。

O血清不凝集時(shí)，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2％～3％）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時(shí)，將菌株接種在0.55％～0.65％半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.3％～0.4％半固體瓊脂的小玻管1次～2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查

。

當(dāng)前第59頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（五）血清學(xué)鑒定2、多價(jià)菌體抗原（O）鑒定在玻片上劃出2個(gè)約1cm×2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測(cè)菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個(gè)區(qū)域下部加1滴多價(jià)菌體（O）抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對(duì)照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1min，并對(duì)著黑暗背景進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽(yáng)性反應(yīng)。

當(dāng)前第60頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)玻板凝集試驗(yàn)當(dāng)前第61頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)四、操作步驟（五）血清學(xué)鑒定3、多價(jià)鞭毛抗原（H）鑒定同2。4、血清學(xué)分型（六）結(jié)果與報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。當(dāng)前第62頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。當(dāng)前第63頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。當(dāng)前第64頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理DNA的體外復(fù)制類似于天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性——退火——延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。當(dāng)前第65頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；3、引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。當(dāng)前第66頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)當(dāng)前第67頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+1、引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。當(dāng)前第68頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+2、酶及其濃度：目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。當(dāng)前第69頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+3、dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCL的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

當(dāng)前第70頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+4、模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。當(dāng)前第71頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+5、Mg2+濃度：Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。當(dāng)前第72頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反應(yīng)條件溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。1、變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。當(dāng)前第73頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反應(yīng)條件溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。2、退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。當(dāng)前第74頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反應(yīng)條件溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。3、延伸溫度與時(shí)間：一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。當(dāng)前第75頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反應(yīng)條件溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。。

當(dāng)前第76頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)PCR擴(kuò)增儀當(dāng)前第77頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（四）電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般在48h以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。當(dāng)前第78頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)當(dāng)前第79頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測(cè)步驟1、引物：P1：5'-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3'，P2：5'-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3'；當(dāng)前第80頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測(cè)步驟2、反應(yīng)體系：總體積為25μL，其中ddH2O15.25μL,10×PCRBuffer(含MgCl2)2.5μL，dNTP(2·5mmol/L)2μL，P1和P2(10μmol/L)各1.25μL，TaqDNA聚合酶0·25μL，模板DNA2.5μL。當(dāng)前第81頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測(cè)步驟3、反應(yīng)條件：94℃，5min94℃，30s60℃，30s35次循環(huán)

72℃，45s72℃，10min當(dāng)前第82頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測(cè)步驟4、DNA的提?。簩⒈粰z菌株接種于3mLLB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)(100r/min)18~24h后，取1mL培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，經(jīng)10000r/min4℃離心5min，棄去上清液，用200μLddH2O或者TE緩沖液(pH8.0)重懸沉淀，再于沸水浴中10min，隨后立即在冰中冷卻，然后在10000r/min及4℃條件下離心5min，取上清液為沙門氏菌基因組DNA模板。當(dāng)前第83頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測(cè)步驟5、電泳檢測(cè)：取5μLPCR產(chǎn)物直接經(jīng)1%瓊脂凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）電泳，凝膠成像儀上觀察拍照結(jié)果。當(dāng)前第84頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)21株沙門氏菌PCR擴(kuò)增電泳圖1-10，14-24為沙門氏菌分離菌株；12為DNAMarkerDL2000；11為沙門氏菌陽(yáng)性對(duì)照；13為陰性對(duì)照當(dāng)前第85頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)三、四沙門氏菌檢驗(yàn)五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（六）特點(diǎn)1、特異性強(qiáng)2、靈敏度高3、簡(jiǎn)便、快速4、對(duì)標(biāo)本的純度要求低當(dāng)前第86頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)五、旋毛蟲病檢疫動(dòng)物性食品衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第87頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)五

旋毛蟲病檢疫一、目的與要求1、學(xué)習(xí)掌握旋毛蟲病的檢疫技術(shù)；2、了解旋毛蟲病的診斷要點(diǎn)和意義。

當(dāng)前第88頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)旋毛蟲病是由旋毛蟲引起的人獸共患寄生蟲病。成蟲（腸旋毛蟲）寄生在哺乳動(dòng)物的腸內(nèi)，幼蟲（肌旋毛蟲）寄生在肌肉組織中且形成包囊。多種動(dòng)物均可感染，肉用動(dòng)物中主要感染豬和狗。本病對(duì)人危害較大，可致人死亡。人旋毛蟲病的發(fā)生主要是由于攝食了生的或未煮熟的含旋毛蟲包囊的豬肉，其次是狗肉。實(shí)驗(yàn)五旋毛蟲病檢疫二、實(shí)驗(yàn)說明當(dāng)前第89頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)當(dāng)前第90頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)1、人和動(dòng)物吞食了含有侵襲性旋毛蟲（成熟的肌旋毛蟲）而受到感染。2、旋毛蟲成蟲與蚴蟲的發(fā)育同在一個(gè)宿主體內(nèi)完成。寄生于宿主小腸（十二指腸、空腸）的成蟲稱腸旋毛蟲；寄生于宿主肌肉組織中的蚴蟲稱肌旋毛蟲。肌旋毛蟲常寄生于膈肌、舌肌、喉肌、頸肌、肋間肌和腰肌等處，其中以膈肌感染率最高，且多聚積在筋頭。3、實(shí)驗(yàn)證明形成包囊的旋毛蟲和未形成包囊的某一生活階段的蚴蟲，均具有感染人和動(dòng)物的能力。實(shí)驗(yàn)五旋毛蟲病檢疫當(dāng)前第91頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)

人感染旋毛蟲后，在病的初期出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉。隨后表現(xiàn)乏力、畏寒、頭痛、發(fā)熱等類似感冒癥狀；并發(fā)生全身肌肉呈持續(xù)性癢痛，尤以下肢腓腸肌和腰部為明顯；同時(shí)出現(xiàn)眼瞼、面部乃至下肢浮腫。有的病人呈現(xiàn)腦炎、腦膜炎、心肌炎等癥狀。后期，急性炎癥消退，除肌肉長(zhǎng)期隱痛及四肢乏力外，一般沒有什么癥狀；耐過患者經(jīng)一定時(shí)間后體力完全恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)五旋毛蟲病檢疫當(dāng)前第92頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)宰前檢驗(yàn)：ELISA（動(dòng)物感染后大都有一定耐受力，往往不顯癥狀。但感染嚴(yán)重的豬和狗，初期食欲減退，嘔吐、腹瀉，以后幼蟲移行時(shí)可引起肌炎，病畜出現(xiàn)肌肉疼痛，麻痹，運(yùn)動(dòng)障礙，聲音嘶啞，發(fā)熱等癥狀）實(shí)驗(yàn)五旋毛蟲病檢疫宰后檢驗(yàn)：主要是病原學(xué)檢查法，其中仍以目檢和鏡檢相結(jié)合的壓片鏡檢法和集樣消化法不失其實(shí)用價(jià)值。

當(dāng)前第93頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)五

旋毛蟲病檢疫三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容壓片鏡檢法當(dāng)前第94頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)⑴采取被檢肌樣：按規(guī)定自肉尸、胴體兩側(cè)橫隔膜肌腳，各取樣1份，每份（兩塊）重量不少于30-50克。與胴體、肉尸編成同一號(hào)碼以便檢疫對(duì)照。⑵目檢：撕去隔肌膜，在充足的陽(yáng)光下，仔細(xì)視檢肉樣表面有無半透明的隆起乳白色、灰白色小點(diǎn)。凡發(fā)現(xiàn)上述小點(diǎn)時(shí)，均應(yīng)仔細(xì)剪下，制成壓片鏡檢。實(shí)驗(yàn)五

旋毛蟲病檢疫當(dāng)前第95頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)⑶壓片標(biāo)本制作：剪取小肉樣制作壓片。用剪刀順肌纖維方向，按隨機(jī)取樣的要求，從檢樣肉上剪取米粒大小的肉24粒，均勻地在夾壓玻璃片上排成兩排，每排12粒。然后壓片，放低倍（50-70倍）顯微鏡下檢查。⑷鏡檢：先從壓片一端第一塊肉片（粒）的邊沿開始，順肌纖維全部觀察，直到他端最后一塊肉片為止。

實(shí)驗(yàn)五

旋毛蟲病檢疫當(dāng)前第96頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)當(dāng)前第97頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)肌旋毛蟲肌旋毛蟲當(dāng)前第98頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)六布魯氏菌病的檢疫動(dòng)物性食品衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第99頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)六、布魯氏菌病的檢疫1、學(xué)習(xí)掌握布魯氏菌病檢疫的基本原理和方法；2、了解血清學(xué)試驗(yàn)在布魯氏菌病檢疫中的作用。

一、目的與要求當(dāng)前第100頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)六、布魯氏菌病的檢疫二、實(shí)驗(yàn)說明布魯氏菌病（Brucellosis，又稱布氏桿菌病，簡(jiǎn)稱布病）是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的人獸共患的常見傳染病。我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。診斷：⑴流行特點(diǎn)，⑵臨床癥狀，⑶病理變化，⑷實(shí)驗(yàn)室診斷（①病原學(xué)診斷a顯微鏡檢查、

b分離培養(yǎng)

②血清學(xué)試驗(yàn)c虎紅平板凝集試驗(yàn)RBPT、d全乳環(huán)狀試驗(yàn)MRT、e試管凝集試驗(yàn)SAT、f補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)CFT）當(dāng)前第101頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)六、布魯氏菌病的檢疫二、實(shí)驗(yàn)說明結(jié)果判定

：1、具有⑴、⑵、⑶時(shí)，判為疑似。2、符合1，且a或b陽(yáng)性時(shí)，判為患病動(dòng)物。3、若為未免疫動(dòng)物，則：

▲c或d陽(yáng)性時(shí)，判為疑似。

◆b或e或f陽(yáng)性時(shí)，判為患病動(dòng)物。★符合▲但e或f陰性時(shí)，30天后應(yīng)重新采樣檢測(cè)，c或e或f陽(yáng)性的判為患病動(dòng)物。

當(dāng)前第102頁(yè)\共有111頁(yè)\編于星期六\1點(diǎn)實(shí)驗(yàn)六、布魯氏菌病的檢疫二、實(shí)驗(yàn)說明布病最常用的檢疫技術(shù)是血清學(xué)診斷。目前我國(guó)常用的血清學(xué)方法有RBPT、SAT和CFT