第四章抗體制藥1

本章目的要求1、掌握單克隆抗體的概念。2、理解制備單克隆抗體的一般流程。3、理解基因工程抗體的制備。4、理解噬菌體抗體庫的基本方法、技術(shù)特點及基因工程抗體的表達。5、掌握抗體診斷試劑的分類。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第1頁\共有52頁\編于星期六\18點學習內(nèi)容（一）1、抗體制藥概述2、單克隆抗體制備的基本過程。3、基因工程抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第2頁\共有52頁\編于星期六\18點第一節(jié)概述?1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。?1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。?70年代中期，日本利根川進證實了Ig的基因結(jié)構(gòu)，獲得1987年的theNobelprize?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第3頁\共有52頁\編于星期六\18點抗體？是指能與相應抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白?？贵w的產(chǎn)生？機體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細胞被活化增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第4頁\共有52頁\編于星期六\18點抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第5頁\共有52頁\編于星期六\18點20世紀60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學功能的概念?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第6頁\共有52頁\編于星期六\18點多克隆抗體polyclonalantibody指由不同B細胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。實際意義：（1）預防、治療感染性疾病，如：破傷風抗毒素血清抗破傷風，副作用：超敏反應（2）臨床診斷，如：肥達氏反應--傷寒、副傷寒缺點：特異性差。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第7頁\共有52頁\編于星期六\18點傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細胞抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第8頁\共有52頁\編于星期六\18點單克隆抗體

monoclonalantibody，McAb1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點，為抗體制備和應用提供了全新的手段，還促進了基礎和臨床醫(yī)學的發(fā)展?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第9頁\共有52頁\編于星期六\18點第二節(jié)McAb及制備一、McAb1、McAb定義

是由一個雜交瘤細胞及其后代所產(chǎn)生的針對一個抗原決定簇的高度特異性和專一性的抗體。2、McAb怎樣產(chǎn)生？

是將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第10頁\共有52頁\編于星期六\18點二、McAb的制備1、抗原與動物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。有的抗原可以用化學合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第11頁\共有52頁\編于星期六\18點為使雜交瘤細胞穩(wěn)定，免疫動物和骨髓瘤細胞供體同一品系動物進行免疫。目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動物也采用相應的品系?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第12頁\共有52頁\編于星期六\18點免疫方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強、抗原量較多時應用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細菌細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔10個細胞進行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第13頁\共有52頁\編于星期六\18點可溶性抗原按每只小鼠10～100

μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原，刺激B細胞分裂?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第14頁\共有52頁\編于星期六\18點脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將0.1～0.2ml抗原注入脾臟進行免疫。細胞抗原需105個，可溶性抗原需10μg。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第15頁\共有52頁\編于星期六\18點

體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。優(yōu)點：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第16頁\共有52頁\編于星期六\18點體外免疫法：用4～8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.5～5μg/ml,在5%CO237C下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細胞,進行細胞融合?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第17頁\共有52頁\編于星期六\18點2、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)細胞融合的方法脾細胞（1×108）骨髓瘤細胞（2～3×107）混合聚乙二醇誘導下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。P25抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第18頁\共有52頁\編于星期六\18點PEG的相對分子質(zhì)量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細胞的毒性也隨之增大。常用濃度為40%~50%，相對分子質(zhì)量4000為佳。相對分子質(zhì)量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內(nèi)的PEG都能使細胞發(fā)生融合。為了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴格限制接觸時間?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第19頁\共有52頁\編于星期六\18點用于細胞融合的骨髓瘤細胞應具有融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體能力強，長期穩(wěn)定。細胞融合后可產(chǎn)生多種融合脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合細胞如何去除脾-瘤以外的融和細胞？選擇性培養(yǎng)－脾-瘤培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。A阻斷DNA合成。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第20頁\共有52頁\編于星期六\18點抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第21頁\共有52頁\編于星期六\18點3、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常用檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等?？寺』侵竼蝹€細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第22頁\共有52頁\編于星期六\18點常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法：把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第23頁\共有52頁\編于星期六\18點4、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定

雜交瘤細胞鑒定：染色體分析。它是鑒定的客觀指標，了解分泌抗體的能力。

單抗進行Ig類和亞類鑒定：用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進行免疫擴散或ELISA鑒定。親和力、特異性、純度、分子量測定?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第24頁\共有52頁\編于星期六\18點雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定—染色體分析正常鼠的脾細胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細胞染色體：SP2/0細胞為62~68，NS-1為54~64，大多數(shù)為非整倍性，有中部和亞中部著絲點。雜交瘤細胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應出現(xiàn)少數(shù)標志染色體。染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細胞分泌高效價的抗體；反之，則反?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第25頁\共有52頁\編于星期六\18點5、

McAb的大量制備體外培養(yǎng)法可獲的10μg/ml抗體體內(nèi)誘生法可獲的5～20mg/ml抗體抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第26頁\共有52頁\編于星期六\18點6、McAb的純化依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：（1）澄清和沉淀處理：1000g離心5min，去除沉淀物（紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊和脂質(zhì)）——20000g高速離心30min,去除殘留的小顆粒物質(zhì)——用0.2μm微孔濾膜過濾，去除細菌、支原體——飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上的抗體）。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第27頁\共有52頁\編于星期六\18點（2）分離A、凝膠過濾：用于IgG和IgM類。常用SephadexG200作為分離介質(zhì)，可收集到3個峰，最高峰為IgM，另外兩個峰為IgG。抗體回收率達50~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達95%以上。B、陰粒子交換層析：用于IgG類的分離純化。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低粒子強度下洗脫下來，其純度很高。IgG2b和IgG3在低粒子強度下易發(fā)生沉淀，可增加粒子強度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低。

C、親和層析：多用蛋白A親和層析。適用于IgG類。IgG類與蛋白A的結(jié)合與pH有密切的關(guān)系。鼠源性單抗在pH8.0時，IgG2b、IgG3幾乎全部結(jié)合在蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5緩沖液可洗脫下IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a，pH6.0可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲的抗體純度和很高，但也有極微量的雜蛋白?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第28頁\共有52頁\編于星期六\18點癌細胞可培養(yǎng)生長漿細胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個

Bcell只產(chǎn)生一種抗體抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第29頁\共有52頁\編于星期六\18點

●

一個B細胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一抗原決定基●若有許多抗原決定基，則需許多株B細胞分別生產(chǎn)許多抗體BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第30頁\共有52頁\編于星期六\18點1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗體分開Turn20抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第31頁\共有52頁\編于星期六\18點

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種B細胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細胞株由脾臟收集B細胞抗原通常有多個抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第32頁\共有52頁\編于星期六\18點-d細胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細胞（Subcloning）

(確定只有一種細胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細胞Bcell脾細胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗專一性對抗原的反應無法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第33頁\共有52頁\編于星期六\18點第三節(jié)基因工程抗體

GeneticEngineeringAntibodyMcAb具有高度特異性、均一性、又有來源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點，促進了基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學等眾多學科的發(fā)展。存在的缺陷，McAb均是鼠源性抗體，應用于人體內(nèi)有排斥反應；完整抗體分子的相對分子量過大，難以穿透腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。降低McAb的免疫原性；降低McAb的相對分子量?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第34頁\共有52頁\編于星期六\18點抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第35頁\共有52頁\編于星期六\18點抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第36頁\共有52頁\編于星期六\18點抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第37頁\共有52頁\編于星期六\18點對鼠源性的McAb進行基因加工和改造目的：降低免疫源性；降低相對分子量方式：一、人-鼠嵌合抗體二、改形抗體三、Fab與Fv抗體四、scFv五、單域抗體和分子識別單位抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第38頁\共有52頁\編于星期六\18點一、人-鼠嵌合抗體ChimericAntibodies人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第39頁\共有52頁\編于星期六\18點構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。構(gòu)建重組表達載體抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第40頁\共有52頁\編于星期六\18點克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調(diào)整其效應。人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第41頁\共有52頁\編于星期六\18點二、改形抗體ReshapingAb（CDR移植抗體）CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改形抗體，也就是人源化抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第42頁\共有52頁\編于星期六\18點經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，結(jié)合半抗原及全抗原(如細胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第43頁\共有52頁\編于星期六\18點人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點突變法全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進一步即可用于構(gòu)建和表達改形抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第44頁\共有52頁\編于星期六\18點定點突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進行操作。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第45頁\共有52頁\編于星期六\18點最小識別單位單域抗體FabFvScFvFab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等都是小分子抗體小分子抗體抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第46頁\共有52頁\編于星期六\18點三、Fabfragmentofantigenbinding重鏈VH加CH1和完整的輕鏈組成,大小為完整分子的1/3把Fab與細菌的前導肽相連，在前導肽的作用下Fab進入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics當前第47頁\共有52頁\編于星期六\18點四、Fv及ScFvFv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。