藥用植物分子鑒定詳解演示文稿

藥用植物分子鑒定詳解演示文稿當前第1頁\共有94頁\編于星期日\14點（優(yōu)選）藥用植物分子鑒定當前第2頁\共有94頁\編于星期日\14點教學內容1.了解遺傳標記定義、類型、優(yōu)缺點，掌握分子遺傳標記定義、原理和在藥用植物鑒定中的應用。熟悉PCR的原理和步驟。2.掌握常用的分子標記（RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SNP）原理和方法。3.重點掌握藥用植物分子鑒定的方法和流程（以柴胡為例）。當前第3頁\共有94頁\編于星期日\14點第一節(jié)遺傳標記（geneticmarker）定義：由一對等位基因差異造成的，能夠明確區(qū)分，遺傳傳遞過程可以跟蹤的相對性狀或生物特征。如形態(tài)上的質量性狀：花瓣顏色、種子顏色、葉片顏色、葉片形狀、種子形狀等。當前第4頁\共有94頁\編于星期日\14點1.形態(tài)標記（MorphologicalMarkers）遺傳學上穩(wěn)定、可見的外部特征---遺傳與環(huán)境、結構基因與調控基因綜合作用的結果，這種標記可以用于研究物種間關系、分類和鑒定。如植株高矮、花瓣顏色、葉片顏色、葉片形狀、種子形狀等。優(yōu)點：簡單、直觀缺點：僅對個體性狀的描述，得出的結論不完善；另外數(shù)量性狀易受環(huán)境影響。遺傳標記的類型當前第5頁\共有94頁\編于星期日\14點孟德爾豌豆雜交試驗所研究的七對性狀

都是典型的形態(tài)學遺傳標記當前第6頁\共有94頁\編于星期日\14點2.細胞學標記（CytologicalMarkers）染色體數(shù)目變異及結構變異，表現(xiàn)在染色體核型如數(shù)目、大小、著絲點位置變異等。優(yōu)點：直觀、快速而經濟缺點：但變異十分有限，當染色體數(shù)目形態(tài)相似時難以分辨。當前第7頁\共有94頁\編于星期日\14點王喻寧等，2013當前第8頁\共有94頁\編于星期日\14點3.生化標記（BiochemicalMarkers）生化標記：指把植物體內的某些生化性狀作為遺傳標記，如貯藏蛋白、同工酶等。這種標記可用于繪制“指紋圖譜”進行植物系統(tǒng)發(fā)育、親緣關系和種類鑒定研究。同工酶：指夠催化相同的化學反應，但分子結構、理化特性等不同的一組酶。當前第9頁\共有94頁\編于星期日\14點3.生化標記（BiochemicalMarkers）優(yōu)點：經濟、方便、成本較低缺點：結構基因表達產物，對非結構基因無能為力；所檢測位點只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時受發(fā)育時期和環(huán)境影響。當前第10頁\共有94頁\編于星期日\14點4.分子標記（molecularmarkers）分子標記是指能夠被檢測出來的DNA序列上的遺傳多態(tài)性（等位差異）。TCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG|||||||||||||||||||||||||||||||||TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG品種1品種2堿基差異長度差異當前第11頁\共有94頁\編于星期日\14點4.1分子標記的檢測方法兩個步驟：獲得目標DNA片段：酶切，擴增（PCR）檢測不同樣品間目標片段的差異（多態(tài)性）：電泳，分子雜交，DNA芯片（高通量）當前第12頁\共有94頁\編于星期日\14點TCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG|||||||||||||||||||||||||||||||||TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG電泳方向品種1品種2品種1品種2長度差異片段電泳檢測：當前第13頁\共有94頁\編于星期日\14點4.2分子標記的特點本質是以核苷酸序列作為標記，一般特點：（1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達與否的限制；（2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異；（3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個基因組；（4）多數(shù)分子標記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。當前第14頁\共有94頁\編于星期日\14點遺傳學上，把共顯性定義為F1代中，雙親的性狀同時表現(xiàn)的現(xiàn)象。共顯性能夠將雜合體和純合體從表現(xiàn)上區(qū)分開。共顯性：F1P1F1當前第15頁\共有94頁\編于星期日\14點通過比較藥用植物種間DNA分子遺傳多樣性差異來鑒別其種類的方法。4.3分子標記的應用：藥用植物分子鑒定狹葉柴胡Bupleurumscorzonerifolium北柴胡BupleurumchinenseChaoetal.2014Phytomedicine

中國柴胡有42種，17變種當前第16頁\共有94頁\編于星期日\14點DNA分子標記技術直接分析生物的基因型，與上述傳統(tǒng)的方法比較，具有下列優(yōu)點：

遺傳穩(wěn)定性：DNA分子作為遺傳信息的直接載體，不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響，每一個體的任一體細胞均含有相同的遺傳信息。因此，用DNA分子特征作為遺傳標記進行物種鑒別更為準確可靠。當前第17頁\共有94頁\編于星期日\14點

遺傳多樣性：DNA分子是由G、A、C、T四種堿基構成，為雙螺旋結構的長鏈狀分子，生物體特定的遺傳信息便包含在特定的堿基排列順序中，不同物種遺傳上的差異表現(xiàn)在這4種堿基排列順序的變化，這就是生物的遺傳多樣性(geneticdiversity)。比較物種間DNA分子的遺傳多樣性的差異來鑒別物種就是DNA分子遺傳標記鑒別(identificationbyDNAmoleculargeneticmarker)。當前第18頁\共有94頁\編于星期日\14點

化學穩(wěn)定性：DNA分子作為遺傳信息的載體，除具有較高的遺傳穩(wěn)定性外，在諸多的生物大分子中，比蛋白質、同功酶等具有較高的化學穩(wěn)定性。不象蛋白質和同功酶那樣，在生物體死亡后，很快失去生物活性，并迅速降解。在陳舊標本中所保存下來的DNA仍能夠用于DNA分子遺傳標記的研究。當前第19頁\共有94頁\編于星期日\14點4.4分子標記的類型分子標記的發(fā)展經歷了三個階段，也稱為三代DNA分子標記：第一代分子標記（以分子雜交為核心）：RFLP；第二代分子標記（以PCR為核心）：RAPD；AFLP；SSR；ISSR分子標記第三代分子標記（以DNA測序為核心）：單核苷酸多態(tài)性(SNP)；表達序列標簽(EST)；ITS當前第20頁\共有94頁\編于星期日\14點聚合酶鏈式反應

PolymeraseChainReaction（PCR）PCR定義：是一種模擬體內DNA復制過程的體外酶促合成特異性核酸片段的技術。PCR原理：以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸引物(15-25堿基)介導，通過DNA聚合酶酶促反應，在體外進行特異DNA序列擴增。當前第21頁\共有94頁\編于星期日\14點PCR三步驟①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右5min，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；當前第22頁\共有94頁\編于星期日\14點②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；當前第23頁\共有94頁\編于星期日\14點③引物的延伸：DNA模板－引物結合物于72℃左右在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。當前第24頁\共有94頁\編于星期日\14點當前第25頁\共有94頁\編于星期日\14點

小結與思考小結：1.四種類型遺傳標記中，分子標記具有其他遺傳標記無法比擬的有點，遺傳穩(wěn)定性、多態(tài)性、化學穩(wěn)定性，在藥用植物或生藥鑒定中應用最為廣泛的標記。2.PCR技術是分子標記的基礎，PCR原理和步驟為：變性-退火-延伸。思考：1.分子標記進行藥用植物鑒定依據的是什么？

2.與三種傳統(tǒng)遺傳標記相比，分子標記優(yōu)勢體現(xiàn)在哪些方面？

3.理解PCR的原理和步驟。當前第26頁\共有94頁\編于星期日\14點

參考書及相關文獻資料參考書：1.《中藥生物工程》,主編:高文遠,上海科學技術出版社.2《中藥現(xiàn)代生物技術》,主編:胡之璧,人民衛(wèi)生出版社.3.《中藥生物技術》,主編:賈景明,化學工業(yè)出版社.參考文獻：1.徐紅,王崢濤,胡之璧.中藥DNA分子鑒定技術的發(fā)展與應用[J].中藥現(xiàn)代化,2003,5(2):24-30.2.

海學忠.DNA分子標記在中藥鑒定中的應用進展[J].中外健康文摘,2012,9(35):442-446.3.陳士林,郭寶林,張貴君等.中藥鑒定學新技術新方法研究進展[J].中國中藥雜志,2012,37(8):1043-1055.當前第27頁\共有94頁\編于星期日\14點第二節(jié)常用的分子標記當前第28頁\共有94頁\編于星期日\14點1.限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）RFLP原理：基因組DNA經限制酶切，可產生大量長短不一的片段。通過電泳可以將這些片段分離開。片段長的遷移速度慢，短的遷移速度快。如果一對等位基因（序列）的限制酶切片段長度不同，則稱為RFLP。以標有放射性同位素或化學標記物質、來自特定基因座的DNA片段為探針，可以檢驗該座位是否存在多態(tài)性。當前第29頁\共有94頁\編于星期日\14點RFLP原理示意圖左邊：等位序列酶切電泳的結果右邊：用探針檢驗的結果。當前第30頁\共有94頁\編于星期日\14點1.1產生RFLP的原因點突變：單個堿基的改變（轉換或顛換），造成失去某個酶切位點或產生一個新的酶切位點，使突變型酶切片段變長或變短。插入突變：使突變型酶切片段變長。缺失突變：使突變型酶切片段變短。當前第31頁\共有94頁\編于星期日\14點1.2RFLP的檢測方法酶切電泳Southern雜交放射自顯影當前第32頁\共有94頁\編于星期日\14點結核分枝桿菌基因組RFLP圖譜當前第33頁\共有94頁\編于星期日\14點RFLP的優(yōu)點標記廣泛存在于生物體內，不受組織、環(huán)境和發(fā)育階段的影響。RFLP標記的等位基因是共顯性的，不受雜交的影響，可區(qū)分純合基因與雜合基因?？僧a生的標記數(shù)目很多，可覆蓋整個基因組。當前第34頁\共有94頁\編于星期日\14點RFLP的缺點標記技術需要酶切，對DNA質量要求高；RFLP的多態(tài)性程度偏低；分子雜交時會用到放射性同位素，對人體和環(huán)境都有害；探針的制備、保存和發(fā)放也很不方便；分析程序復雜、技術難度大、費時、成本高。當前第35頁\共有94頁\編于星期日\14點1.3RFLP的應用1.遺傳學圖的構建結合RFLP連鎖圖，任何能用RFLP探針檢測出的基因及其DNA片段都可以通過回交，快速有效地進行轉移。2.基因定位利用RFLP技術能夠準確地標記定位種質中的目標基因，結合雜交，回交及組織培養(yǎng)等技術就可以快速有效的將所需目標基因的DNA片段引入栽培品種中，實現(xiàn)品種改良。當前第36頁\共有94頁\編于星期日\14點3.遺傳多態(tài)性分析運用RFLP技術可以盡可能多地保存那些在已知位點上有異態(tài)的品系，以求最大程度地保持品種的多樣性。4.細胞質遺傳研究RFLP技術是對DNA序列自然變異的直接檢測，只需選擇適當?shù)南拗菩詢惹忻富駾NA探針作分子標記，因而對植物不同種屬或雜種后的細胞質遺傳變異及基因型的鑒定具有較高的靈活性和靈敏性，從而能較好地應用于細胞質遺傳的研究。當前第37頁\共有94頁\編于星期日\14點2.隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）RAPD原理：建立于PCR基礎之上，使用一系列具有10個左右堿基的單鏈隨機引物，以較低的退火溫度（36℃），對基因組的DNA全部進行PCR擴增，以檢測多態(tài)性。由于整個基因組存在眾多反向重復序列，因此須對每一隨機引物單獨進行PCR。單一引物與反向重復序列結合，使重復序列之間的區(qū)域得以擴增。當前第38頁\共有94頁\編于星期日\14點

引物結合位點DNA序列的改變以及兩擴增位點之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導致擴增片段數(shù)目和長度的差異，經聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后通過EB(溴化乙錠)染色以檢測DNA片段的多態(tài)性。當前第39頁\共有94頁\編于星期日\14點RAPD原理示意圖當前第40頁\共有94頁\編于星期日\14點當前第41頁\共有94頁\編于星期日\14點OPA1:5’-CAGGCCCTTC-3’OPD11:5’-AGCGCCATTG-3’OPD8:5’-GTGTGCCCCA-3’OPD11OPD8OPA11北柴胡(陜西)

2北柴胡(河北)

3竹葉柴胡4大葉柴胡5小葉黑柴胡6狹葉柴胡MMarkerRAPD的應用-分類鑒定當前第42頁\共有94頁\編于星期日\14點RAPDanalysisof27saffloweraccessionsfromeightdifferentgeographicalregionswithOperonprimerAA-04.AA-04producedsevenpolymorphicbands當前第43頁\共有94頁\編于星期日\14點Lanes1and26:ladder1Kb;Lanes2to27:melon.Arrowsindicatepolymorphicmarkersusedforanalysis.當前第44頁\共有94頁\編于星期日\14點RAPD的優(yōu)點：技術簡單，實驗周期短，信息量大，檢測速度快；DNA用量少；實驗設備簡單，不需DNA探針，設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析；不依賴于種屬特異性和基因組的結構，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析；用一個引物就可擴增出許多片段，幾乎覆蓋整個基因組，而且不需要同位素，安全性好。當前第45頁\共有94頁\編于星期日\14點RAPD缺點：顯性遺傳，不能識別雜合子位點，這使得遺傳分析相對復雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖時，會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性下降；RAPD對反應條件相當敏感，包括模板濃度、Mg2+濃度，所以實驗的穩(wěn)定性和重復性差。當前第46頁\共有94頁\編于星期日\14點在RAPD和RFLP技術基礎上建立了SCAR(Sequencecharacterizedamplifiedregions，序列特異性擴增區(qū)域)，CPAS(Cleavedpolymorphicamplifiedsequence，酶切擴增多態(tài)序列)和DAF(DNAamplifiedfingerprints，DNA擴增指紋)等標記技術。這些技術的出現(xiàn)，進一步豐富和完善了第一代分子標記，增加了DNA多態(tài)性的研究手段。當前第47頁\共有94頁\編于星期日\14點3.SSR標記技術SSR原理：在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復序列，如重復單位長度在15～65個核苷酸的小衛(wèi)星DNA，重復單位長度在2～6個核苷酸的微衛(wèi)星DNA。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位點。由于重復單位的大小和序列不同以及拷貝數(shù)不同,從而構成豐富的長度多態(tài)性。當前第48頁\共有94頁\編于星期日\14點

定義：SSR（全稱為簡單序列長度多態(tài)性標記）也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(多為1～5個)堿基組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列，其中最常見的是雙核苷酸重復，即(CA)n和(TG)n，每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結構相同，重復單位數(shù)目10～60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。當前第49頁\共有94頁\編于星期日\14點根據微衛(wèi)星重復序列兩端的特定短序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復數(shù)目不同，因而擴增出不同長度的PCR產物，這是檢測DNA多態(tài)性的一種有效方法。微衛(wèi)星序列在群體中通常具有很高的多態(tài)性，而且一般為共顯性，因此是一類很好的分子標記。當前第50頁\共有94頁\編于星期日\14點SSR原理示意圖SSR：以2－6個堿基為單位的短重復序列CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTCTTCTTCCGTACATCAGATAG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTC......CGTACATCAGATAG上游引物下游引物SSR長度（重復數(shù)）容易產生變異相對保守相對保守當前第51頁\共有94頁\編于星期日\14點SSR的檢測當前第52頁\共有94頁\編于星期日\14點SSR標記的優(yōu)點在基因組中數(shù)量豐富，分布較均勻存在復等位基因，多態(tài)性水平較高一般表現(xiàn)為共顯性，信息完整基于PCR技術，簡單方便SSR標記的缺點開發(fā)成本高，需知道基因組序列，只有全基因組已完成測序的植物才能方便地開發(fā)。當前第53頁\共有94頁\編于星期日\14點4.ISSR（SSR間區(qū)）在SSR序列上設計引物PCR檢測相鄰SSR位點之間區(qū)段的長度多態(tài)性穩(wěn)定性比RAPD好SSRSSR上游引物下游引物當前第54頁\共有94頁\編于星期日\14點SNP原理：SNP主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。也即SNP是同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化。

主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉換或顛換、以及單堿基的插入或缺失等。5.單核苷酸多態(tài)性標記(SNP)當前第55頁\共有94頁\編于星期日\14點單核苷酸多態(tài)性（SNP）

數(shù)量非常豐富，有廣闊應用前景?！瑿AAGATCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG…||||||||||||||||||||||||||||||||||||…CAAGACCTTGGAGACTAACTATAG.....GCGTACATCGGATAG…SNP當前第56頁\共有94頁\編于星期日\14點檢測SNP基因型的生化原理當前第57頁\共有94頁\編于星期日\14點SNP的特點：

SNP與RFLP及SSR標記的不同有2個方面：其一，SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記；其二，SNP標記分析完全摒棄了經典的凝膠電泳，代之以最新的DNA芯片技術。對成千上萬個克隆測序，用計算機分析數(shù)據和顯示最終結果。當前第58頁\共有94頁\編于星期日\14點檢測：

DNA芯片技術，最新報道的微芯片電泳(Microchipelectrophoresis)，可以高速度地檢測臨床樣品的SNP。雜交型芯片將等位基因特異寡核苷酸共價固定在載體表面，用熒光標記引物擴增基因組DNA，再與芯片上的寡核苷酸雜交形成信號，并行讀取芯片上不同SNP熒光信號，獲得SNP信息。當前第59頁\共有94頁\編于星期日\14點SNP的優(yōu)點

數(shù)量多，分布廣泛，檢測快速、易于實現(xiàn)自動化，遺傳穩(wěn)定性高。SNP的缺點成本高，錯誤信號多。當前第60頁\共有94頁\編于星期日\14點SNP標記的應用

種群生物學特征、遺傳性疾病檢測、疾病關聯(lián)分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因組作圖和數(shù)量性狀定位等方面也有越來越多的應用。當前第61頁\共有94頁\編于星期日\14點第三節(jié)藥用植物的分子鑒定流程（實例）當前第62頁\共有94頁\編于星期日\14點

DNA測序法（DNASequencing）目前用于DNA測序的基因主要有：1.有葉綠體基因組的rbcL、matK；2.核基因組的rRNA、ITS等(植物類)；3.線粒體基因組的cty-b(動物類)。當前第63頁\共有94頁\編于星期日\14點rbcL：基因分辨率高，變異較均一分布，進化速率差異大，一般用于科級以上分類群研究。matK：位于trnK基因的內含子中，長約1500堿基，編碼成熟酶并參與RNA轉錄體中Ⅱ型內含子的剪切，是葉綠體基因組蛋白編碼基因中進化速率最快的基因之一，變異較均一，一般用于種一級分類群親緣關系研究。當前第64頁\共有94頁\編于星期日\14點rRNA是編碼核糖體DNA的基因，在植物中以重復連續(xù)排列方式存在，包含進化速率不等的編碼區(qū)、非編碼轉錄區(qū)和轉錄區(qū)，可選擇較保守的片斷如18S、5S的rRNA進行各種親緣關系研究。當前第65頁\共有94頁\編于星期日\14點

1.串聯(lián)重復序列，拷貝可達500~40000；不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致。核核糖體內轉錄間隔區(qū)Nuclearribosomeinternaltranscribespacer,ITS當前第66頁\共有94頁\編于星期日\14點

2.序列短，具有長度保守性(ITS1:187-298bp，ITS2:187-252bp)核核糖體內轉錄間隔區(qū)Nuclearribosomeinternaltranscribespacer,ITS當前第67頁\共有94頁\編于星期日\14點

3.核苷酸序列的高度變異性(每個區(qū)成對序列趨異百分率在4~10%)

4.兩側都有高度保守的序列當前第68頁\共有94頁\編于星期日\14點材料與方法收集中國境內柴胡標本29種36份，基本涵蓋民間入藥的所有品種。名稱憑證標本采集時間采集地點多枝柴胡B.polyclonum謝暉0405170012004年5月云南會澤川滇柴胡B.candollei謝暉0405170022004年5月云南會澤柴胡（栽培）B.chinense晁志、張道廣03080162003年8月陜西鎮(zhèn)巴小柴胡B.hamiltonii晁志、張道廣03080012003年8月云南昆明狹葉柴胡（紅柴胡）B.scorzonerifolium晁志、張道廣03070012003年7月安徽肥東空心柴胡B.longicaulevar.franchetii晁志、張道廣03080112003年8月陜西鎮(zhèn)巴當前第69頁\共有94頁\編于星期日\14點竹葉柴胡B.marginatum晁志、張道廣03080022003年8月云南昆明抱莖柴胡B.longicaulevar.mplexicaule晁志、張道廣03080032003年8月云南昆明麗江柴胡B.rockii晁志、張道廣03080092003年8月云南麗江柴胡(野生)B.chinense晁志、張道廣03080202003年8月陜西鎮(zhèn)巴汶川柴胡（馬尾柴胡）B.wenchuanense晁志、張道廣03080512003年8月四川汶川馬爾康柴胡B.malconense晁志、張道廣03080532003年8月四川汶川柴首B.chaishoui晁志、張道廣03080542003年8月四川汶川四川柴胡B.sichuanense晁志、張道廣03080522003年8月四川汶川南方大葉柴胡B.longiradiatumf.australe晁志、張道廣03070032003年7月安徽黃山韭葉柴胡B.kunmingense潘勝利03871981年8月云南昆明當前第70頁\共有94頁\編于星期日\14點窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllum潘勝利05061993年7月云南昆明線葉柴胡B.angustissimum潘勝利05161993年8月寧夏同心矮小柴胡B.hamiltoniivar.humile潘勝利03201980年8月云南麗江大葉柴胡B.longiradiatumvar.breviradiatum潘勝利04601986年8月黑龍江尚志煙臺柴胡B.chinensef.vanheurckii潘勝利04991992年8月山東青島瀘西柴胡B.luxiense潘勝利04141983年8月云南建水長白柴胡B.komarovianum潘勝利04701986年8月吉林長白山大苞柴胡B.euphorbioides潘勝利04681986年8月吉林長白山大葉柴胡B.longiradiatumvar.breviradiatum王峻03090012003年9月黑龍江細莖有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerum晁志、張道廣03080102003年8月云南麗江當前第71頁\共有94頁\編于星期日\14點北柴胡B.chinense晁志、張道廣03000012003年8月陜西太白山窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllum晁志、張道廣03080552003年8月甘肅柴胡B.gansuense潘勝利05131993年8月甘肅榆中縣柴胡（栽培）B.chinense謝暉、劉峰林、徐志斌0407210012004年7月甘肅小隴山柴胡B.chinense謝暉、劉峰林、徐志斌0407240012004年7月甘肅天水黑柴胡B.smithii謝暉0407270012004年7月甘肅榆中黃花鴨趾柴胡B.commelynoideumvar.flaviflorum謝暉0407280012004年7月甘肅榆中興安柴胡B.sibiricum潘勝利05191993年8月內蒙古大青山銀州柴胡B.yinchowense謝暉、劉峰林、徐志斌0407230012004年7月甘肅小隴山小柴胡B.hamiltonii徐士奎04080012004年8月川滇交界當前第72頁\共有94頁\編于星期日\14點基因組DNA提?。悍謩e使用CTAB法和植物基因組小量抽提試劑盒提取植物基因組DNA。1%瓊脂糖電泳檢測。-20℃冰箱保存，備用。材料與方法當前第73頁\共有94頁\編于星期日\14點

ITS序列擴增：ITS序列采用5P、4P雙引物進行擴增，引物序列分別為：“ITS5P”-5’>GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG<3’，“ITS4P”-5’>TCCTCCGCTTATTGATATGC<3’。

反應體系(50μL)：10×PCR發(fā)應緩沖液5.0μL，dNTP(2.5mmol/Leach)3.0μL,Taq酶1U，引物(10μmol/L)各5.0μL，模板1-5μL。當前第74頁\共有94頁\編于星期日\14點反應程序：93℃5min，55℃2min；93℃30s，55℃45s，70℃45s，循環(huán)35次；70℃5min。擴增產物經膠回收試劑盒對目標條帶進行純化，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，備用。當前第75頁\共有94頁\編于星期日\14點單克隆挑選與測序膠回收純化后的ITS序列直接測序，部分結果有雙峰出現(xiàn)。此結果可能與多拷貝在進化過程中尚未形成完全一致的序列有關，因此通過使用T載體，隨機挑取單克隆測序以獲得樣品ITS序列。當前第76頁\共有94頁\編于星期日\14點序列分析：1.

ClustalX軟件進行進行比對，選擇一條嚴格一致序列作為該樣本的代表序列，并于Genbank登陸。2.使用DNAssist2.2軟件對本研究中獲得的序列進行兩兩比對，并計算同源性。同時所獲得序列與外類群序列進行兩兩比對，計算同源性。當前第77頁\共有94頁\編于星期日\14點結果：圖1.1％瓊脂糖凝膠電泳檢測試劑盒提取所得植物基因組DNA。圖中標號為樣品編號。60ng－15ng為不同量的λDNA上樣，其分子量為48kb，用以標示完整植物基因組的大小，同時對獲得的DNA樣本半定量，上樣體積均為5μL。當前第78頁\共有94頁\編于星期日\14點圖2.1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測不同樣本ITS序列擴增結果。M標示分子量MarkerL2000，數(shù)字標號為樣品編號。PCR產物及其左側分子量Marker為同塊膠電泳檢測，每組PCR反應均設有陰性對照，結果均為陰性。上樣量5μL。結果：當前第79頁\共有94頁\編于星期日\14點圖3.1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測不同樣本PCR擴增產物目標條純化結果。M標示分子量MarkerDL2000，數(shù)字標號為樣品編號。結果：當前第80頁\共有94頁\編于星期日\14點圖4.1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測6號、9號DNA樣本PCR產物純化后連接產物轉化Top10細胞結果。結果：當前第81頁\共有94頁\編于星期日\14點結果：36份樣品中共獲得27條ITS序列的嚴格一致序列名稱序列編號Genebank登錄號多枝柴胡B.polyclonumY1DQ285463川滇柴胡B.candolleiY2DQ285471柴胡（栽培）B.chinenseS1DQ285452小柴胡B.hamiltoniiY3DQ285472狹葉柴胡（紅柴胡）B.scorzonerifoliumO1DQ285465空心柴胡B.longicaulevar.franchetiiS2DQ285453當前第82頁\共有94頁\編于星期日\14點竹葉柴胡B.marginatumY4DQ285467抱莖柴胡B.longicaulevar.amplexicauleY5DQ285469麗江柴胡B.rockiiY6DQ285458柴胡(野生)B.chinenseS3DQ285449汶川柴胡（馬尾柴胡）B.wenchuanenseC1DQ285461馬爾康柴胡B.malconenseC2DQ285446柴首B.chaishouiC3DQ285462四川柴胡B.sichuanenseC4DQ285447南方大葉柴胡B.longiradiatumf.australeA1DQ285460窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllumY7DQ285468當前第83頁\共有94頁\編于星期日\14點線葉柴胡B.angustissimumN1DQ285464細莖有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerumY8DQ285459柴胡B.chinenseS4DQ285450窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllumO2DQ285466柴胡（栽培）B.chinenseG2DQ285448柴胡B.chinenseG3DQ285451黑柴胡B.smithiiG4DQ285455黃花鴨趾柴胡B.commelynoideumvar.flaviflorumG5DQ285456興安柴胡B.sibiricumM1DQ285457銀州柴胡B.yinchowenseG6DQ285454小柴胡B.hamiltoniiO3DQ285470當前第84頁\共有94頁\編于星期日\14點A1Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8A1南方大葉柴胡Y1多枝柴胡97.37Y2川滇柴胡90.9090.31Y3小柴胡90.4189.9898.84Y4竹葉柴胡89.9289.8293.7193.21Y5抱莖柴胡89.4189.6694.3794.0495.52Y6麗江柴胡97.8596.7290.1089.6089.4489.27Y7窄竹葉柴胡87.9387.3692.5592.0696.8594.3687.62Y8細莖有柄柴胡97.3796.2289.6489.1488.9888.8299.5187.17G2柴胡（栽培）96.5395.8990.5690.0189.2489.4096.3787.4295.72ITS序列比對結果ResultsofthehomologousalignmentofITSsequences當前第85頁\共有94頁\編于星期日\14點A1Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8G2G3G4G5G6C1C2C3C4M1G3柴胡95.3794.9189.5989.0988.7888.1095.7187.1195.2397.52G4黑柴胡98.0297.2190.4389.6089.9389.9397.8588.1297.3796.5395.71G5黃花鴨趾柴胡98.1897.3790.5990.1090.1090.1098.0288.2897.5396.7095.8799.83G6銀州柴胡96.6996.8890.9190.4189.9289.9297.6988.1097.2098.5197.6997.6997.85C1汶川柴胡97.0397.5489.6489.6289.1389.1396.5487.4896.0595.5594.7397.0397.2096.71C2馬爾康柴胡96.0395.4090.2389.7489.0789.0795.8787.0995.3999.6797.1996.2096.3798.1895.22C3柴首97.0397.7089.4689.4688.9689.1396.5487.1596.0595.5594.7397.0397.2096.7098.8595.22C4四川柴胡96.0395.7390.2589.7589.2689.2695.8787.2795.5699.6797.1996.2096.3798.1895.3999.3395.39M1興安柴胡98.1897.3790.5990.1090.1090.1098.0288.2897.5396.7095.8799.8399.8397.8597.2096.3797.2096.37O1狹葉柴胡97.8597.2190.7490.2590.2589.9297.3688.4396.8896.3695.8797.8598.0297.5296.8796.0397.3696.2098.51ITS序列比對結果ResultsofthehomologousalignmentofITSsequences當前第86頁\共有94頁\編于星期日\14點A1Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8G2G3G4G5G6C1C2C3C4M1O1O2O3N1S1S2S3S4O2窄竹葉柴胡89.4288.6793.7193.2199.5095.3688.9496.8588.4988.9188.6089.4489.6089.4288.6388.5888.4788.7889.6089.75O3小柴胡90.4190.3199.5099.0194.0494.5490.2692.8889.8090.7389.7590.5990.7691.0789.7990.4089.6290.4190.7690.9093.87N1線葉柴胡97.8597.0490.7690.2690.2690.1097.3688.7896.8896.3795.8797.8598.0297.5296.8796.0496.8796.0498.0299.0089.7790.92S1柴胡（栽培）96.3895.8989.7989.2989.2988.8096.8787.4896.2297.3697.8696.7196.8797.6995.5597.0395.7297.0396.8796.7188.9689.9596.71S2空心柴胡96.3696.2289.5789.0789.0788.9196.3787.5896.0597.5296.6996.8697.0397.6995.7297.1995.7297.0297.0396.5388.7489.7496.5397.53S3柴胡（野生）96.5395.8990.7390.2389.4089.5796.3787.5895.8999.1797.6996.7096.8698.6895.7298.8495.7298.8496.8696.5389.0790.8996.5397.5397.68S4柴胡96.3695.3790.5690.0789.2289.3996.2087.4095.8999.0197.5296.5396.7098.5195.7298.6896.0598.6896.7096.8688.8990.7396.3797.3697.5299.50Carumcarvi71.5771.5070.0271.3671.9771.7171.9570.1571.7171.8572.4071.7871.9571.9071.2971.5270.7971.5771.9572.4071.8171.8572.2872.6572.3572.5271.97Conioselinumchinense73.2273.0773.8473.6872.6473.0973.6070.7873.1973.6873.5573.4373.6073.7272.9873.3473.1573.3973.6074.2172.4774.0173.6073.3173.6873.8474.30Oenanthejavanica71.0769.6271.0371.0370.8170.0070.9668.8270.5670.3670.5870.4170.6370.9169.3670.3669.1970.0870.6370.9170.1571.1970.3070.3570.1570.7070.78Laserpitiumhispidum69.0968.9769.0469.7067.6667.5070.1366.8369.9068.8769.0969.4769.6469.4268.7068.5469.1968.6069.6469.4267