人促紅細胞生成素在細胞上的表達

人促紅細胞生成素在細胞上的表達第一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六促紅細胞生成素的理化性質

EPO是由165個氨基酸組成的高糖基化蛋白質，去唾液酸或去糖基化不影響重組人EPO的體外生物活性，但卻縮短了在體內的半衰期，使其完全喪失了在體內的活性，說明糖基對其生物活性是至關重要的，因此基因工程的EPO不能利用原核表達系統(tǒng)，只能利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)（如CHO細胞）生產第二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六關于EPO人促紅細胞生成素是一種由腎臟產生的高度糖基化蛋白,是紅系細胞發(fā)育過程中最重要的調節(jié)因子。天然存在的EPO藥源極為匱乏,須從貧血病人尿中提取,不能滿足社會的需要。1985年Jacob等成功地從胎兒肝中克隆出EPO基因,使通過基因工程手段大量生產重組EPO成為可能。第三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六關于EPO國外用人促紅細胞生成素gDNA(genomicDNA)在哺乳動物細胞中已獲得高效表達,而在我國雖也有重組產品問世,但存在表達水平偏低,生產成本偏高的問題,不能滿足大規(guī)模工廠化生產和臨床應用的需要,因此迫切需要提高EPO在細胞中的表達量。為此,我們開展了EPO在CHO細胞中的表達研究,希望能獲得比較理想的效果。第四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六實驗目的：獲得人促紅細胞生成素(EPO)的高效表達第五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六三、實驗儀器及耗材實驗試劑與器材氨甲喋呤(MTX)、煌焦油藍購于Sigma公司;rHuEPO體內生物學活性測試工作標準品為Amgen公司產品;Lipofectamine、犢牛血清、F12與D-MEM細胞培養(yǎng)基購自Gibco/BRL公司;EPOELISAkit購自BoehringerMannheim公司;96孔與24孔細胞培養(yǎng)板為Costar產品。第六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六三、實驗儀器及耗材實驗材料菌株DH5α,JM109均由本實驗室保存。質粒質粒pD、p38(內含EPOgDNA)由本實驗室保存,pcDNA3購自Invitrogen公司,pSV40dhfr由PaulBerg實驗室構建,本實驗室保存。工具酶各種限制性內切酶均購自華美生物工程公司,T4DNA連接酶與牛小腸堿性磷酸酶購自Gibco/BRL公司,DNA聚合酶I大片段(Klenow)購自Promega公司第七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六三、實驗儀器及耗材細胞株CHO-dhfr-細胞由本室保存。實驗動物雌性BALB/c小鼠,6~8周齡。第八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六方法以EPOgDNA為基礎構建了兩個真核表達載體pDE、pCE,將它們分別經脂質體轉染CHO-dhfr-細胞,其48h瞬時表達量分別為27·5ng/ml與88·90ng/ml。然后用氨甲喋呤(MTX)對轉染細胞進行加壓并挑選細胞克隆,共獲得3株高效表達EPO的工程細胞株A,B,C,其中A來自質粒pCE,B和C來自pDE,在2×10-6mol/L的MTX的壓力下,它們48h的最高表達水平分別為A:8·7μg/mlB:10·76μg/ml,C:16·44μg/ml。經網織紅細胞法測得它們均具有體內生物活性。第九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六網織紅細胞計數

(一)原理網織紅細胞是晚幼紅細胞脫核后但尚未完全成熟的紅細胞,胞質中尚有核糖體、核糖核酸等嗜堿性物質殘存,經煌焦油藍或新亞甲藍活體染包后,胞質中可見藍或藍綠色枝點狀甚至網織狀結構。

(二)方法活體染色法.近年來還可通過某些血液自動分析儀及流式細胞術檢測法進行網織紅細胞計數。第十頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六四·實驗步驟質粒的轉化、酶切、去磷、連接、重組子質粒的鑒定等基因操作

細胞的轉染按lipofectamine使用說明書進行,在此過程中質粒要經特定的內切酶線性化,在pCE中采用BglⅡ,pDE則采用EcoRⅠ,其中質粒pCE要與經EcoRⅠ線性化的質粒pSV40-dhfr共轉染。細胞克隆的篩選CHO-dhfr-細胞在轉染質粒48h后,經胰蛋白酶消化后進行細胞計數,用F12培養(yǎng)液將其稀釋成1×104cells/ml,置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞形態(tài)恢復正常后,換用D-MEM培養(yǎng)液置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),約15d后出現肉眼可第十一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六實驗步驟見的細胞克隆此時可用彎頭吸管挑取細胞克隆至96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),同時在培養(yǎng)液中添加MTX,其初濃度為1×10-8mol/L,以每10d為一個周期,倍比地提高MTX的濃度。在適當的時候將96孔板內的細胞轉入24孔細胞培養(yǎng)板中,然后再轉入30ml細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),至此細胞克隆工作即告完成。在挑選克隆的過程中,應挑取加壓后表達水平提高較明顯的細胞株,而非一開始表達量較高的細胞。細胞表達上清中EPO含量的檢測采用BoehringerMannheim公司的EPOELISAkitEPO生物活性的測定采用網織紅細胞計數法第十二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六五·實驗結果1·真核表達載體pDE、pCE的構建

將質粒p38經SalⅠ酶切后,回收長為2·4kb的EPOgDNA片段,除EPO蛋白編碼區(qū)外,其5’非翻譯區(qū)長120bp,3’非翻譯區(qū)長200bp。同時將真核表達載體pD、pcDNA3分別用SalⅠ、HindⅢ線性化,線性化的pD經CIP去磷后與EPO基因片段按適當的比例溫合連接,獲得重組質粒pDE;將線性化的質粒pcDNA3與EPO基因片段均經Klenow補平,并且將線性化的pcDNA3經CIP去磷,兩者按適當比例混合后用T4DNA連接酶連接,得重組質粒pCE。質粒pCE與pDE的物理圖譜如下。第十三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六實驗結果第十四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六·2瞬時表達結果將質粒用lipofectamine轉染CHO細胞后48h,收集細胞上清,經PBS稀釋100倍后,用ELISA測定其EPO的濃度,結果見表1。第十五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六3穩(wěn)定表達·經MTX篩選后得到的三個高表達細胞株A、B、C,在MTX的濃度為2×10-6mol/L時,測定它們48h細胞上清中EPO的濃度,樣品均用PBS稀釋10000倍,結果見表2。第十六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六4EPO體內生物活性的測定

經過網織紅細胞法,測得工程細胞株A,B,C48h穩(wěn)定表達上清中的EPO含有體內生物活性,其體內活性值分別為A:848·3IU/ml,B:1049·1IU/ml,C:1602·9IU/ml。第十七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六六·討論真核基因表達不僅可以生產大量的感興趣蛋白,而且在細胞遺傳學與生物學中具有廣泛的應用,因此研究基因在真核細胞中的表達具有極其重要的理論及實踐意義。外源基因在哺乳動物細胞中的表達受許多因素的影響,如轉錄水平、轉錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面,其中尤以轉錄水平的調節(jié)最為重要。在細胞中轉錄水平的調控是由基因的順式作用元件與細胞內存在的反式作用因子之間的相互作用來實現,由于在特定的細胞內,反式作用因子是固定的,不可改變的,因此基因的表達主要取決于其順式作用元件的作用。第十八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六對外源基因而言,也就是決定于特定的表達載體中的啟動子,一個合適的啟動子可將外源基因的表達水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對于特定的基因和細胞,各啟動子起始轉錄的效率有很大的差別,因此我們認為在進行外源基因的表達研究中,應考慮選用幾種不同的強啟動子,才有可能獲得較為理想的表達效果。目前外源蛋白在真核細胞中的穩(wěn)定表達均采用了選擇擴增系統(tǒng),其中以二氫葉酸還原酶基因擴增系統(tǒng)研究最為清楚,應用最為廣泛?？梢酝ㄟ^MTX的漸次加壓選擇而進行極大地增加外源基因的拷貝數,從而提高外源蛋白的產量。第十九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期六有關文獻報道認為與dhfr基因共轉染的DNA傾向于同它一起整合于細胞染色體的共同區(qū)域,當用MTX進行加壓篩選時,它們將同時進行擴增。但我們的研究表明共轉染時加壓效果不明顯,這可能是由于它們并未整合于染色體的相同位點所致。因此我們認為最好選用dhfr基因與目的基因串聯(lián)在一起的載體來進行表達,加壓效果較為明顯。我們的表達結果明顯高于國內報