當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效部位指紋圖譜歸屬分析

當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效部位指紋圖譜歸屬分析【摘要】目的分析當(dāng)歸補(bǔ)血湯的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇部位的特征峰在復(fù)方全方及在單味藥中的歸屬。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Shim-PackVP-ODS柱，250mm×mm，流動相為甲醇-水，檢測波長為280nm，流速為1ml/min。結(jié)果復(fù)方石油醚部位的9個特征峰5個來自當(dāng)歸,4個來自黃芪；氯仿部位的9個特征峰6個來自黃芪，3個來自當(dāng)歸；醋酸乙酯部位的11個特征峰，7個同時來自當(dāng)歸和黃芪，1個來自當(dāng)歸，3個來自黃芪；正丁醇部位的7個特征峰，6個同時來自于當(dāng)歸和黃芪,1個來自黃芪。結(jié)論復(fù)方各部位的指紋圖譜為闡明各部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)，為下一步的臨床應(yīng)用以及新藥的開發(fā)提供參考。

【關(guān)鍵詞】當(dāng)歸補(bǔ)血湯單味藥有效部位指紋圖譜高效液相色譜

中藥有效部位可以在保留原方治療優(yōu)點的基礎(chǔ)上提高中藥的作用強(qiáng)度、臨床藥效以及質(zhì)量控制水平，改變傳統(tǒng)中藥大、黑、粗外觀形象，是中藥研究的又一新的發(fā)展點［1］，是研發(fā)中藥二類新藥依據(jù)［2，3］，也是從中藥開發(fā)新藥的第3條途徑［4］。王明軍等［5］論述了中藥有效部位研究的現(xiàn)狀、方法和手段，并闡明用中藥指紋圖譜對中藥提取物進(jìn)行質(zhì)量控制。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯為中醫(yī)經(jīng)典名方之一，始載于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》,按黃芪∶當(dāng)歸=5∶1組成，具有補(bǔ)氣生血等功效。對該復(fù)方的HPLC及GCMS實驗研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯成分極其復(fù)雜［6，7］；根據(jù)模型不同，不同部位可用于不同疾病的治療［8，9］，對該復(fù)方某部位指紋圖譜的研究也有報道［10～12］。為獲得當(dāng)歸補(bǔ)血湯各部位更全面的信息，本文建立了當(dāng)歸補(bǔ)血湯的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇部位的指紋圖譜，并找到了這些部位的特征峰在復(fù)方全方及在單味藥中的歸屬,為各部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

Agilent1100系列高效液相色譜儀；G1315A型二極管陣列檢測器。當(dāng)歸購自甘肅岷縣，黃芪購自長沙九之堂藥店，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所鑒定。阿魏酸與芒柄花素對照品，甲醇為色譜純,水為二次去離子水，其余試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

色譜條件ShimPackVPODS柱，mm×250mm，流動相組成：A相和B相，B相的體積分?jǐn)?shù)在0～10min為1%～25%，10～20min為25%～50%，20～30min為50%～70%，30～50min為70%～90%；流速ml/min；柱溫為室溫25℃；檢測波長280nm。

供試品溶液的制備

當(dāng)歸補(bǔ)血湯復(fù)方全方的制備稱取黃芪和當(dāng)歸粉末各8g，g，加8倍量和6倍量70%的乙醇，分別回流提取2h和1h，將所得醇提物蒸干，殘渣加甲醇溶解定容到25ml。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯復(fù)方及單味藥各有效部位的提取

復(fù)方有效部位的提?。悍謩e稱取黃芪和當(dāng)歸粉末各20，4g，加8倍量和6倍量70%的乙醇，分別回流提取2h和1h，將所得醇提物蒸干，殘渣均勻分散于48ml水中，使其含量為g藥材/ml，水溶液依次用同體積石油醚、氯仿、醋酸乙酯，正丁醇各萃取3次，各部位提取液蒸干，殘渣加甲醇溶解定容到10ml，即為復(fù)方的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇部位。

單味藥的有效部位的提取：分別稱取黃芪、當(dāng)歸粉末各20，4g，同法操作，制備單味藥黃芪，當(dāng)歸的相應(yīng)部位。

精密度實驗取“”項下樣品20μl，按擬定方法連續(xù)進(jìn)樣6次，用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，所得相似度為5，2，6，1，0，5，相似度極高，說明供試品進(jìn)樣精密度良好。

重復(fù)性實驗按“”項下方法，平行實驗5次，分別取20μl，按擬定方法進(jìn)樣，用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，所得相似度為2，2，8，3，1，相似度極高，說明方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性實驗取同一復(fù)方供試液20μl分別在0，6，12，24，48h進(jìn)樣5次的，用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，所得相似度為0，9，8，7，2，相似度極高，說明48h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。結(jié)果表明樣品指紋圖譜各色譜峰相對遷移時間和峰面積基本一致，相似度較高，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

供試品溶液的檢測取上述樣品各20μl，分別進(jìn)樣，阿魏酸、芒柄花素、復(fù)方全方及復(fù)方單味藥各部位的HPLC指紋圖譜見圖1～6。主要特征峰峰面積百分含量見表1。表1樣品主要特征峰峰面積相對百分含量

3討論

從圖2可以看出復(fù)方成分復(fù)雜，對響應(yīng)值較大的21個峰編號分析，經(jīng)阿魏酸與芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品對照，確認(rèn)峰7為當(dāng)歸中阿魏酸，峰18為黃芪中芒柄花素。此外，通過解析得到的光譜與文獻(xiàn)［13，14］對照，對另外5個峰初步定性為：峰9：毛蕊異黃酮苷；峰14：毛蕊異黃酮；峰16：峰值最大為主要特征，從表1看出其峰面積百分含量為%，表明該部位提取出的是極性很小的脂溶性物質(zhì)。該部位中峰22在復(fù)方全方中沒找到，可能是由于濃度原因：提取復(fù)方全方時，取g藥材提取液蒸干后，為保證殘渣的完全溶解，用甲醇溶解定容到25ml；而在提取有效部位時，取24克藥材提取蒸干，石油醚萃取殘渣水溶液后，石油醚液蒸干，殘渣用甲醇溶解定容到10ml，依此計算石油醚部位濃度是全方的倍，濃度的增大使復(fù)方全方中沒檢測到的峰22在石油醚部位中出現(xiàn)。

對復(fù)方及單味藥的氯仿部位的譜圖分析從圖4可以看出，復(fù)方氯仿部位的9個特征峰，6個來自黃芪，3個來自當(dāng)歸，即峰3，9，14，15，16，18來自黃芪，峰7，11，12來自當(dāng)歸。從表1中看出該部位是14號峰和18號峰峰值最大的部位，峰面積百分含量分別為%和%，表明該部位提取出的主要是黃芪中的黃酮類，異黃酮類物質(zhì)，以黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素峰值較高為主要特征。

復(fù)方及單味藥中醋酸乙酯部位的譜圖分析從圖5可以看出，復(fù)方該部位的11個峰，7個同時來自當(dāng)歸和黃芪，1個來自當(dāng)歸，3個來自黃芪，即峰2,3,5,11,12,13,21同時來自當(dāng)歸和黃芪，峰7來自當(dāng)歸，峰9,14,18來自黃芪，以7號峰峰值最大為主要特征，其峰面積百分含量為%。復(fù)方醋酸乙酯部位中峰18在黃芪中的該部位中沒有找到，可能是黃芪中的成分比復(fù)方少很多，單味藥黃芪中芒柄花素在用氯仿提取時已完全提取出，而復(fù)方中成分較多，或者復(fù)方中其他組分的影響不利于芒柄花素的提取，用氯仿沒有完全提取出，因而在復(fù)方醋酸乙酯部位中還有少量。同時當(dāng)歸中峰20即E-藁苯內(nèi)酯在復(fù)方醋酸乙酯部位中沒有，卻有少量在當(dāng)歸此部位，可能是黃芪中的某組分能促進(jìn)E-藁苯內(nèi)酯的提取，使其在復(fù)方的氯仿部位中已完全提取出，因而在復(fù)方醋酸乙酯部位中沒有出現(xiàn)。

復(fù)方及單味藥中正丁醇部位的譜圖分析為了清楚地顯示該部位的峰，取色譜峰流出的時間段，如圖5所示，該部位提取的物質(zhì)除峰9，14外，其余物質(zhì)集中在保留時間段0～15min流出,表明該部位提取的主要是極性較強(qiáng)的物質(zhì)，以2號峰峰值最大為主要特征，其峰面積百分含量為%。該部位主要有7個峰，6個同時來自當(dāng)歸和黃芪，1個峰來自黃芪，即峰1,2,3,4,5,6同時來自于當(dāng)歸和黃芪,峰9來自黃芪，在黃芪的正丁醇部位峰14即毛蕊異黃酮,在復(fù)方中該部位中沒有，原因可能類似于“”中E-藁苯內(nèi)酯的溶出情況。

從表1可以看出，當(dāng)歸中阿魏酸在復(fù)方全方，復(fù)方氯仿，復(fù)方醋酸乙酯部位中均存在，其含量分別為%,%,%，石油醚及正丁醇部位中卻沒有，判斷阿魏酸肯定不溶于石油醚，用氯仿萃取時，可能由于阿魏酸在氯仿中的溶解度較小，或者復(fù)方其他物質(zhì)的影響，不利于阿魏酸的完全溶出，即使用同體積的氯仿萃取了3次還是沒能把它完全提取出，醋酸乙酯萃取時，該物質(zhì)完全萃取出了。表明阿魏酸主要集中在醋酸乙酯部位，該部位則是與阿魏酸藥效最相關(guān)的部位。除了阿魏酸還有其他物質(zhì)出現(xiàn)在不同的有效部位，其含量卻有較大差別，這種現(xiàn)象可能是由于用有機(jī)試劑萃取全方時難以完全把該物質(zhì)萃取出，或者有機(jī)試劑之間有影響，同一物質(zhì)能溶于所選的不同試劑，但溶解情況有較大差異，不同部位提取出的主要物質(zhì)不同，將有不同的臨床療效。

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