丁酸鈉誘導(dǎo)Raji細(xì)胞基因表達(dá)的變化

丁酸鈉誘導(dǎo)Raji細(xì)胞基因表達(dá)的變化【摘要】目的分析丁酸鈉誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的基因表達(dá)變化，探討丁酸鈉誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制。方法限制性顯示PCR技術(shù)(RestrictionDisplayPCR，RDPCR)分析基因表達(dá)變化，利用互聯(lián)網(wǎng)提供的GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)分析比對(duì)獲得的差異表達(dá)序列。結(jié)果獲得14條差異表達(dá)序列，其中6條是對(duì)照組高表達(dá)序列，8條是實(shí)驗(yàn)組高表達(dá)序列。結(jié)論采用RDPCR技術(shù)可以快速簡(jiǎn)便地分析藥物誘導(dǎo)基因表達(dá)變化。分析表達(dá)差異的序列發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的基因表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】限制性顯示PCR技術(shù)；丁酸鈉；凋亡；基因表達(dá)

ChangeofGeneExpressioninRajiCellsInducedbySodiumButyrate

Abstract：ObjectiveThisstudywasdesignedtoanalyzethechangeofgeneexpressionandinvestigatethemechanismofapoptosisinducedbysodiumbutyrate.MethodsThechangeofgeneexpressionwasanalyzedbyRestrictionDisplayPCR.Thedifferencesexpressedsequencesweresequenced.NucleicacidsequenceswereanalyzedbyusingtheGenBankininternet.ResultsFourteendifferentialexpressedsequencesweregained，ofwhich6highexpressedsequenceswereincontrolcellsand8highexpressedsequenceswereinducedbysodiumbutyrate.ConclusionThechangeofgeneexpressioninducedbydrugscouldbeanalyzedRDPCRmethodsquicklyandsimply.GeneexpressionthatpromptedcellapoptosiswasupregulatedinducedbysodiumbutyratewhileGeneexpressionthatwashighexpressionintumorcellswasdownregulated.

Keywords：RestrictionDisplayPCR；Sodiumbutyrate；Apoptosis；Geneexpression

0引言

Raji細(xì)胞是懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)的，但我們前期研究發(fā)現(xiàn)Raji細(xì)胞在丁酸鈉的處理下可由懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)狀態(tài)，伴隨有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[1]。我們研究小組擬通過(guò)RDPCR顯示mRNA表達(dá)差異來(lái)揭示丁酸鈉誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡時(shí)基因表達(dá)的變化，試圖尋找造成細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化的主要基因，探討丁酸鈉作用的可能機(jī)制。

1材料和方法

主要試劑丁酸鈉(SB)，溴化乙錠；DNA回收試劑盒；mRNA純化試劑盒，限制性內(nèi)切酶Sau3AI，DNA連接試劑盒，LATag酶，RNasin，T4DNA連接酶，dNTP，PMD18TVector，JM109細(xì)菌；丙烯酰胺，N，N’–甲叉雙丙烯酰胺，瓊脂粉，瓊脂糖，Tag酶，低熔點(diǎn)瓊脂糖；胰蛋白胨，酵母提取物(英國(guó)OXIOD公司)；Tris飽和酚；逆轉(zhuǎn)錄酶，TRIzol試劑，DEPC；RPMI1640；小牛血清；100bpDNALadder；氯仿，異丙醇。

細(xì)胞培養(yǎng)Raji細(xì)胞株(來(lái)源于中山大學(xué)腫瘤防治中心)以含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于5%CO2中培養(yǎng)。

細(xì)胞mRNA的提取將生長(zhǎng)狀況良好的Raji細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為×106/ml，加入3mmol/L丁酸鈉，37℃、5%CO2培養(yǎng)?？俁NA的提取按照Invitrogen公司提供的TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。最后加30μlDEPC處理水溶解總RNA。參照mRNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，從總RNA中純化mRNA。

從mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA及雙鏈cDNA末端平滑化逆轉(zhuǎn)錄按照Invitrogen公司的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，mRNA約2μg，dNTP/L，OligdT15μmol/L，65℃，5min，加MMLV200U和酶反應(yīng)緩沖液，37℃延伸時(shí)間75min。cDNA樣品20μl，70℃，10min。加入5μlT4DNAPolymerase，5μl10×T4DNAPolymeraseBuffer，5μl%BSA，μl/LdNTP，μl滅菌水，輕柔混勻。37℃反應(yīng)5min。加入25μlEDTA(pH)和25μl10%的SDS，輕柔混勻，停止反應(yīng)。加入100μl酚/氯仿溶液，振蕩，混勻。10000g離心1min，液相分離，將上層水相轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中。加入1/10體積3mol/LNaAc、倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻。-20℃，靜置30min。4℃離心13000g×10min，棄上清，75%乙醇洗沉淀1～2次，晾干。

的酶切cDNA溶于20μl水中，定量后，取大約2μg進(jìn)行酶切反應(yīng)。16USau3AI，37℃進(jìn)行酶切反應(yīng)，時(shí)間不少于2h。

接頭與cDNA酶切片段的連接采用PCR引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)兩條單鏈寡核苷酸片段來(lái)生成接頭，sip：5’pGATCCACACCAGCCAAACCCA3’，SIR:5’GGTTTGGCTGGTGTG3’。接頭生成按如下進(jìn)行：SIP(500μg/mlinwater)20μl，SIR(380μg/mlinwater)20μl?；旌虾螅?0℃，→80℃，→70℃，→60℃，→50℃，→40℃，→30℃，→20℃，→4℃保持。分裝后，貯藏于-20℃?zhèn)溆?。接頭與cDNA酶切片段的連接參照TaKaRaDNA連接試劑盒說(shuō)明及所提供的試劑，步驟cDNA酶切反應(yīng)液5μl，接頭5μl，SolutionII10μl，SolutionI20μl。混合均勻后，于16℃連接，時(shí)間不少于1h。

PCR反應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)與SIR/SIP接頭配套的通用引物U，其序列為GGTTTGGCTGGTGTG。設(shè)計(jì)的限制性引物是在通用引物的GATC3’端分別加上一個(gè)堿基A、T、C、G，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為引物A、T、C、G，引物序列如表1。

表1RDPCR的限制性引物

將引物A、T、C、G兩兩組合，共有10組，以接頭與cDNA酶切片段的連接產(chǎn)物為模板，進(jìn)行限制性分組PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件①97℃2min；②95℃30s，65℃30s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；③72℃5min；④4℃保持。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠中平行電泳。經(jīng)EB染色后，在紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的基因表達(dá)差異，參照DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收差異條帶。

純化后PCR產(chǎn)物與載體連接轉(zhuǎn)化測(cè)序?qū)⒓兓腜CR產(chǎn)物與pMD18TVector連接，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：pMD18TVectorμl，PCR產(chǎn)物μl，SolutionIμl，16℃連接3h。轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌。陽(yáng)性克隆的挑取、鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)。目的基因片段由上海博雅公司測(cè)序。

生物信息學(xué)分析差異片段測(cè)序后在因特網(wǎng)上登錄NCBI的網(wǎng)址，通過(guò)AdvanceBLAST程序進(jìn)行同源性分析。在GeneBank中搜索是否有和所發(fā)現(xiàn)的片段同源的基因，同源性比較見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分。

2結(jié)果

PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，EB染色用引物A、T、C、G兩兩組合，共有10種組合，分別為AA、AT、AC、AG、TT、TC、TG、CC、CG、GG10組。對(duì)從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞中獲得的cDNA進(jìn)行限制性分組PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物平行地在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，經(jīng)EB染色后，如圖1。聚丙烯酰胺凝膠電泳，偶數(shù)泳道為對(duì)照組，奇數(shù)泳道為實(shí)驗(yàn)組，可明顯看出平行的兩組基因表達(dá)方面的差異。

差異片段的測(cè)序與生物信息分析結(jié)果差異片段的測(cè)序在上海博雅公司進(jìn)行。測(cè)序生物信息分析結(jié)果，見(jiàn)表2。

1：標(biāo)準(zhǔn)分子量；2：AA組；3：AA組；4：AT組；5：AT組；6：AC組；7：AC組；8：AG組；9：AG組；10：TT組；11：TT組；12：TC組；13：TC組；14：TG組；15：TG組；16：CC組；17：CC組；18：CG組；19：CG組；20：GG組；21：GG組

圖1RDPCR電泳圖

3討論

RDPCR技術(shù)的思路是在獲得反轉(zhuǎn)錄的cDNA之后，進(jìn)行Sau3AI酶切。Sau3AI識(shí)別位點(diǎn)是四個(gè)堿基，理論上計(jì)算平均每256個(gè)堿基有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。在酶切片段的兩端加上由15bp和21bp長(zhǎng)的兩條互補(bǔ)寡核苷酸單鏈逐步退火形成的通用接頭，接頭的一端為4個(gè)堿基的粘性端GATC，恰好與選用的Sau3AI的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，另一端為2個(gè)堿基的粘性端CA，可以減少片段自身間的串聯(lián)。酶切片段加上接頭之后，用與接頭序列配套的限制性引物進(jìn)行擴(kuò)增(見(jiàn)表1)。將各引物兩兩組合，共10組，以接頭與cDNA酶切片段的連接物為模板，進(jìn)行限制性分組PCR反應(yīng)，各組產(chǎn)物在電泳和染色后，容易觀察基因差異表達(dá)。

表2差異表達(dá)序列的分析結(jié)果

現(xiàn)已知丁酸鈉可以通過(guò)抑制去乙?；父淖?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的改變。我們研究小組利用RDPCR來(lái)揭示丁酸鈉誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡時(shí)基因表達(dá)的變化，探討丁酸鈉作用的可能機(jī)制。現(xiàn)對(duì)獲得的差異片斷分析討論。對(duì)照組細(xì)胞高表達(dá)的基因有6條。gi|4504150|ref|NM_|是人granulin(GRN)片斷。Progranulin和它的水解產(chǎn)物granulin也稱(chēng)畸胎瘤細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子(PCcellderivedgrowthfactor，PCDGF)或epithelin，可刺激細(xì)胞增殖，使細(xì)胞錨著非依賴(lài)性生長(zhǎng)。研究表明PCDGF作為一種自分泌生長(zhǎng)因子與多種腫瘤，例如乳腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的發(fā)生、侵襲及細(xì)胞存活密切相關(guān)[3,4]。gi|5817109|emb||HSM800843來(lái)源于人DKFZp566D143克隆cDNA，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其功能。gi|3882182|dbj||來(lái)源于人KIAA0731蛋白編碼序列。有文獻(xiàn)報(bào)道KIAA0731蛋白在濾泡狀甲狀腺瘤中表達(dá)上調(diào)。gi|33466037|gb||來(lái)源于人線粒體基因序列。尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其功能。gi|188427|gb||HUMMHDRS02來(lái)源于人HLADRalphachain(chainp34)基因外顯子2、3、4和5。文獻(xiàn)報(bào)道Raji細(xì)胞表面HLADR抗原表達(dá)率為%。gi|15431298|ref|NM_|來(lái)源于人核糖體蛋白L18(RPL18)的mRNA序列，全長(zhǎng)648bp。有研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白L18的mRNA在人類(lèi)結(jié)腸癌組織的表達(dá)比普通的結(jié)腸組織高。實(shí)驗(yàn)組高表達(dá)的基因序列8條：gi|33466037|gb||和gi|13272612|gb||來(lái)源于人線粒體基因序列，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其功能。gi|17065925|emb||HSDJ622L5與人染色體同源，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其功能。gi|37046837|gb||來(lái)源于人核糖體蛋白L23a的mRNA序列。全長(zhǎng)985bp，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其功能。gi|34784771|gb||來(lái)源于人葡萄糖磷酸異構(gòu)酶mRNA，全長(zhǎng)3020bp，與糖代謝有關(guān)。gi|10441945|gb||AF218008來(lái)源于人克隆PP3501的mRNA，功能未明，可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。gi|9966820|ref|NM_|來(lái)源于人溶酶體三磷酸腺苷雙磷酸酶類(lèi)似蛋白1：14381441.

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