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差別顯示技術(shù)詳解演示文稿本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第1頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分優(yōu)選差別顯示技術(shù)本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第2頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分
高等生物大約有3~5萬(wàn)個(gè)不同的基因,在每一個(gè)正常的體細(xì)胞中都含有相同的基因組拷貝,但在不同的組織細(xì)胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達(dá),這種選擇性表達(dá)是在發(fā)育過程中細(xì)胞分化的根本原因,是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過程的核心機(jī)制。因此,比較不同組織之間,或相同組織在不同生理?xiàng)l件下,或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達(dá)差異,可分離并克隆出這些特異性表達(dá)的基因。近年來,該領(lǐng)域的研究取得了很大進(jìn)展,扣除雜交(subtractivehybridization,SH)、基因芯片技術(shù)(DNAchiptechnique)、基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、噬菌體全套抗體庫(kù)技術(shù)(phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique)和雙向電泳技術(shù)(two-dimensionalgelelectrophoresis)先后成功地建立。一.概述本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第3頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。指在對(duì)信號(hào)或誘導(dǎo)物做出應(yīng)答時(shí),選擇表達(dá)不同的基因,或使基因的表達(dá)水平有所不同?;虿町惐磉_(dá)本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第4頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強(qiáng)有力的工具在隨后幾年里,Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn),使技術(shù)更適用、更簡(jiǎn)便基于RT-PCR理論,依賴于3種技術(shù)1)RT-PCR技術(shù)2)以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3)DNA電泳技術(shù)
本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第5頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分二.基本概念
mRNA差別顯示技術(shù)也稱為差示反轉(zhuǎn)錄PCR(DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR)簡(jiǎn)稱為ddRT-PCR。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因。本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第6頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分
反轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。其原理是:提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí),使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于:分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)即逆轉(zhuǎn)錄PCR,是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,可用于檢測(cè)細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平,細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。反轉(zhuǎn)錄PCR本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第7頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分RNA指紋
RNA首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下使RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,之后以其DNA為模板,通過以DNA指紋技術(shù)建立指紋圖譜進(jìn)行分析。DNA指紋
某些DNA序列的差異可通過限制性酶切片段長(zhǎng)度的改變反映出來,此即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。其主要原因是由于DNA序列個(gè)別堿基的突變而引起某個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的獲得或丟失,表現(xiàn)為不同長(zhǎng)度的酶切片段.本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第8頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分水稻品種DNA指紋本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第9頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分基本原理
利用所有真核基因的mRNA的3’端都有一段多聚腺苷酸poly(A)尾結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),將不同來源的總mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,此cDNA合成是采用oligo(dT)12MN為引物,其中M為A,C,G中的任意一種,N為A,C,G或T中的任意一種,共有12種oligo(dT)12MN引物,其中M為錨定堿基可增大引物的Tm值,N稱為分類堿基,對(duì)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分類。用這12種引物分別對(duì)同一總mRNA樣品進(jìn)行cDNA合成,即進(jìn)行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到12種類型的cDNA,從而也將總mRNA分為12個(gè)亞群。在此基礎(chǔ)上對(duì)每一類cDNA進(jìn)行隨機(jī)引物和相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物PCR擴(kuò)增,由于擴(kuò)增的cDNA片段被放射性同位素標(biāo)記,因而利用放射自顯影技術(shù)通過對(duì)不同組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析,從而反映出不同樣品間基因的時(shí)間和空間上的組織特異性的表達(dá)。本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第10頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分
基本原理是,幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端,都帶有一個(gè)多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu),即通常所說的poly(A)尾巴。因此,在RNA聚合酶的作用下,可按mRNA為模板,以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據(jù)mRNA分子3’-末端序列末端結(jié)構(gòu)的分析可以看到,在這段poly(A)序列起點(diǎn)堿基之前的一個(gè)堿基,除了為A的情況之外,只能有C、G、T三種可能。根據(jù)這種序列結(jié)構(gòu)特征,P.Peng等人設(shè)計(jì)合成三種不同的下游引物,它由11個(gè)或12個(gè)連續(xù)的脫氧核苷酸加上一個(gè)3’-末端錨定脫氧核苷酸組成,用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示,這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是,采用這三種引物,可以將整個(gè)mRNA群體在cDNA水平上分成三個(gè)亞群體。然后用一個(gè)上游的隨機(jī)引物和與反轉(zhuǎn)錄時(shí)相同的oligo(dT)引物對(duì)這個(gè)cDNA亞群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,因?yàn)檫@個(gè)上游的引物將隨機(jī)結(jié)合在cDNA上,因此來自不同mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是不同的,可以在測(cè)序膠上明顯分辨開來,從而篩選出不同樣品間基因差異表達(dá)的DNA片段。本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第11頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第12頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分5’
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C,N為A、T、G、C)
啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶,再擴(kuò)增,克隆測(cè)序,同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第13頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分(1)提取總RNA,在這個(gè)步驟中注意不能有DNA污染,一般用無RNA酶的DNA酶在37℃下處理30min;(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,以O(shè)ligoT11MN為引物(M為G、A、C中的任一種,N為A、C、G、T任一種),進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;(3)PCR反應(yīng),擴(kuò)增cDNA的第一條鏈;(4)擴(kuò)增后的cDNA進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,使差異表達(dá)的cDNA片段在6%測(cè)序膠上分開;(5)找出不同處理間差異顯示的條帶,從膠上切割下來,并回收,再進(jìn)行第二次擴(kuò)增;(6)克隆差異片段,差異片段可作為探針;(7)Northern雜交,驗(yàn)證目的片段,去掉假陽(yáng)性片段;(8)對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序;(9)以克隆的目的片段為探針,從基因組文庫(kù)中篩選出相應(yīng)的全長(zhǎng)基因。技術(shù)一般步驟本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第14頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第15頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第16頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分放射性自顯影技術(shù)放射性自顯影法與普通照相的曝光、顯影、定影原理相似,此法是利用放射性同位素所放出之射線使照相乳膠“感光”,再經(jīng)顯影和定影處理,將乳膠中因受輻照而致敏的鹵化銀顆粒還原成金屬銀,洗去未“感光”的鹵化銀后則圖像自然顯示出來。圖像中任何區(qū)域的黑度取決于留存的金屬銀的量,它反映了射線在這個(gè)區(qū)域所沉積的能量。記錄、檢查和測(cè)量整體和組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平中放射性示蹤物的分布、進(jìn)行定性和半定量測(cè)定,稱為放射自顯影法。
本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第17頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分DD的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)靈敏度高,僅需0.2μg的總RNA因?yàn)閺膬煞N或更多的特定組織樣品來源的擴(kuò)增產(chǎn)物在同一塊膠上鑒定,因此能用于鑒定特定組織或細(xì)胞來源樣品之間轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的定性和定量變化可以同時(shí)檢測(cè)到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時(shí)間短,實(shí)驗(yàn)過程中可步步驗(yàn)證比較可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析
本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第18頁(yè);編輯于星期六\4點(diǎn)9分DD的缺點(diǎn)
每種技術(shù)的誕生都不可能是完美的,mRNA差異顯示技術(shù)雖然從創(chuàng)立時(shí)起就很受歡迎,但是許多研究者發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定缺陷,其中三點(diǎn)較為突出:第一,操作步驟多,外源DNA污染嚴(yán)重而導(dǎo)致假陽(yáng)性率高,即差異片斷用Northern雜交時(shí)無陽(yáng)性信號(hào),重復(fù)穩(wěn)定性較差。據(jù)研究,這種假陽(yáng)性率可高達(dá)70%第二,獲得的差異條帶短小,多為300bp左右,并且多為3’端非編碼區(qū)序列(UTR),難以直接判斷其功能和意義。第三,必須采用放射性同位素標(biāo)記反應(yīng),使得實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高、易造成同位素污染,且不好回收差異片斷。本文檔共20頁(yè);當(dāng)前第1
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