參環(huán)毛蚓體內(nèi)核苷磷酸化酶的活性測定及動力學(xué)分析論文

第第頁參環(huán)毛蚓體內(nèi)核苷磷酸化酶的活性測定及動力學(xué)分析論文1材料與方法

1.1儀器及試劑P680ALPG高效液相色譜系統(tǒng)、ASI100自動進(jìn)樣器、UVD170U紫外檢測器，美國戴安公司;TL18M臺式高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械討論全部限公司;TG16W微量高速離心機(jī)，湖南湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司;SG8200HE超聲波清洗機(jī)，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司;BP211D十萬分之一精密電子天平，德國賽多利斯公司。

1.2試驗動物樣本采自廣東省廣州市番禺區(qū)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥高校李薇教授鑒定為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaasperfillum(E.Perrier)。選擇體型健碩、活力較強(qiáng)、性成熟、體表具有明顯生殖環(huán)帶、平均濕質(zhì)量約14.1g的健康成蚓，經(jīng)無菌超純水清洗后，放入鋪有潮濕滅菌濾紙的塑料箱中，在室溫(22±2)℃下，避光培育48h以備用。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與樣品處理

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密稱取肌苷標(biāo)品3.88mg，次黃嘌呤標(biāo)品2.51mg，分別置于2mL量杯中，用PBS緩沖液溶解并定容至10mL的容量瓶，均稀釋為500滋mol·L1作為母液，置于4℃冰箱中備用。

1.3.2參環(huán)毛蚓粗蛋白的制備解剖活體參環(huán)毛蚓，去除腸道后剪取體壁組織用PBS緩沖液浸泡潤洗3次，轉(zhuǎn)移至培育皿剪碎后用勻漿器研磨，以0.1mo·lL1pH7.4的PBS緩沖液為溶劑，將組織液轉(zhuǎn)移至離心管，4℃12000r·min1離心30min，將提取液分裝，20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ孕∨Ｑ宓鞍?BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，采納Bradford法測定粗蛋白含量。

1.4色譜條件采納EcosilC18AQ柱(250mm×4.6mm，5滋m)，流速為0.8mL·min1，柱溫為室溫，檢測波長為254nm。流淌相A為10mmol·L1磷酸二氫銨緩沖液，用磷酸調(diào)pH至4.5，B為10%甲醇。采納梯度洗脫：0～10minAB(50∶50)，10～15minAB(20∶80)，15～25minAB(0∶100)，25～35minAB(0∶100)。

2結(jié)果

2.1方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1方法專屬性在優(yōu)化的色譜條件下，肌苷峰型良好，與代謝產(chǎn)物分別良好。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與檢測限取次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)液，用PBS緩沖液稀釋成0.5，2，4，5，10，15，20，40滋mol·L1的系列標(biāo)準(zhǔn)液，取10滋L按色譜條件進(jìn)行HPLC分析，測定次黃嘌呤含量(n=5)。以次黃嘌呤峰面積Y為縱坐標(biāo)，次黃嘌呤濃度(X，滋mol·L1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果說明次黃嘌呤在0.5~40滋mol·L1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回來方程為：Y=0.0653X0.0394，r=0.9996。次黃嘌呤檢測限為0.05滋mol·L1(S/N≥3)。

2.2肌苷在參環(huán)毛蚓組織粗蛋白中的酶反應(yīng)動力學(xué)

2.2.1蛋白濃度考察為了考察參環(huán)毛蚓體壁組織酶反應(yīng)體系中合適的蛋白濃度，以不同蛋白濃度(X)與產(chǎn)物次黃嘌呤的濃度增加量繪制曲線。結(jié)果說明樣品的蛋白濃度在0～7.5mg·mL1范圍內(nèi)，與產(chǎn)物濃度改變量呈線性關(guān)系，因此在該濃度范圍內(nèi)的廣地龍粗蛋白提取物可用于酶活性分析。

2.2.2孵育時間考察為了考察適當(dāng)?shù)牡姆跤龝r間，以產(chǎn)物濃度與孵育時間繪制曲線，結(jié)果見圖3。在0～30min的反應(yīng)時間內(nèi)，酶促反應(yīng)呈線性上升，而30min后，酶活力基本穩(wěn)定，說明酶促反應(yīng)已完成，處于穩(wěn)定狀態(tài)，應(yīng)選用孵育時間30min作為酶活力測定的時間。

3商量

在酶活性的檢測方法中，高效液相色譜法因其靈敏度高、選擇性好而應(yīng)用廣泛，尤其是對目標(biāo)成分的檢測能做到快速、精確、實時的特點，更受國內(nèi)外學(xué)者的歡迎。本討論參考了文獻(xiàn)有關(guān)HPLC方法，并以此為基礎(chǔ)對流淌相的比例、梯度洗脫條件進(jìn)行了改良及優(yōu)化，實現(xiàn)了底物與產(chǎn)物之間的良好分別。

對酶活性的測定是通過檢測單位時間、單位體積中底物的削減量或產(chǎn)物的增加量來實現(xiàn)的，即測定酶反應(yīng)的速度。而酶反應(yīng)速率受蛋白濃度和反應(yīng)時間影響，只有當(dāng)反應(yīng)速率與蛋白濃度及孵育時間均顯線性關(guān)系時，才是酶活性的真實表現(xiàn)。因此，本討論考察了酶反應(yīng)體系所需的最正確蛋白濃度和孵育時間。首次建立了參環(huán)毛蚓體內(nèi)次黃嘌呤代謝酶活性測定相關(guān)的試驗體系，為進(jìn)一步討論平喘有效物質(zhì)的代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制供應(yīng)了良好的試驗平臺。

鑒于國外有討論學(xué)者已從寄生蟲和哺乳類動物體內(nèi)發(fā)覺PNP是主導(dǎo)次黃嘌呤生成的關(guān)鍵酶。因此，本討論選取了PNP作為討論對象。此外，與嘌呤合成代謝途徑相關(guān)的酶還有腺苷脫氧酶(ADA)和黃嘌呤氧化酶(XO)。本試驗除了PNP外，