遺傳學 7. 細菌遺傳（改后）

第7、8章細菌和病毒的遺傳

遺傳分析和基因定位

真核生物的基因定位1.Two-pointtestcross2.Threepointtestcross

Geneticmaporlinkagemap

著絲點作圖(centromeremapping)—脈孢霉第一節(jié)細菌的遺傳分析和基因定位

遺傳學：形態(tài)--細胞水平分子水平

細菌--研究材料采用了新的生物類型特點：結構簡單、周期短、不進行減數分裂，DNA裸露，易接受相同或不同物種DNA片段插入。1333um2x1um大腸桿菌的染色體結構堿基對：4639229bp預測基因數4377個研究細菌遺傳的方法--平板培養(yǎng)Clone106

Plating一細菌的遺傳分析

一個細菌DNA與另一個細菌DNA的交換重組可以通過四種方式實現：轉化、接合、性導、轉導1.細菌的轉化與基因定位1.1轉化（transformation）（1）transformation某些細菌(或其他生物)通過其細胞膜攝取周圍供體的染色體片段，并將此外源DNA片段通過重組整合到自己染色體組的過程。Avery(1944)等研究證實，轉化因子是DNA

枯草桿菌大腸桿菌（2）轉化的過程（1%）供體DNA與受體細胞間的接觸與互作

轉化片段大小:肺炎雙球菌轉化DNA片段至少要有

800bp，枯草桿菌最少需要16000bp

轉化片段形態(tài):轉化片段必須是雙鏈轉化片段濃度：每個細胞攝取的DNA分子數受體細胞生理狀態(tài):感受態(tài)(competence)細胞能接受外源DNA分子并被轉化的細菌細胞

感受態(tài)因子：促進轉化作用的酶或蛋白質分子轉化DNA的攝取和整合

聯(lián)會

synapsis

整合

intergration結合與穿入

binding轉化子重組個體A202.avi轉化過程MechanismofnaturaltransformationFig.14.10BacterialtransformationFig17.5Abacterialgrowthcurve.?2003JohnWileyandSonsPublishers被轉化菌株（transformant）比例：

（1）隨外源DNA的濃度而升高，（2）與受體菌的生理狀態(tài)有關。Transformation轉化（transformation）是指受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，整合到基因組中，從而獲得供體菌的部分遺傳性狀。供體菌與受體菌之間不需要直接接觸。FragmentsofdonorDNAentertherecipientandalteritsgenotypeNaturaltransformation（自然轉化）：Artificialtransformation（人工轉化）：

轉基因----遺傳轉化根癌農桿菌（Agrobacterium

tumefaciens）和發(fā)根農桿菌（Agrobacterium

rhizogenes）。轉移DNA（transferredDNA，T-DNA）：T-DNA也叫三螺旋DNA，是指一種由三股ssDNA旋轉螺旋成的一種特殊結構。農桿菌Ti(tumorinducing)或Ri(rootinducing)質粒中的一段DNA序列。植物細胞轉化的共整合系統(tǒng)：T-DNA在大腸桿菌質粒上，含有E.coli的選擇標記和植物選擇標記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質粒轉化到農桿菌中，質粒與Ti質粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質粒上，用于侵染植物細胞。T-DNA重組分子整合到植物細胞染色體DNA上，Kmr篩選轉化細胞。當兩個基因緊密連鎖時，它們就有較多的機會包括在同一個DNA片段中，并同時整合到受體染色體中。如：

trp2+

his2+tyr1+×trp2

his2tyr1↓

重組型數Trp2-his2重組值=×100%

親型數+重組型數(3)轉化和基因重組作圖轉化結果3660trp2his2tyr1

∣←──34─→∣←───13──∣

∣←─────40──────→∣

Trp2-his2→0.34Trp2-tyr1→0.40His2-tyr1→0.13

2.細菌的接合與基因定位作圖2.1接合(conjugation)

–

菌株間雜交性別（1）接合現象的發(fā)現1946年，Lederberg和Tatum實驗E.coli

K12A菌株：甲硫氨酸met-、生物素bio-

鏈霉素敏感

B菌株：蘇氨酸t(yī)hr-、亮氨酸leu-

抗鏈霉素黎德伯格和塔特姆的接合(雜交)試驗證明大腸桿菌發(fā)生遺傳重組原養(yǎng)型缺陷型缺陷型混合

發(fā)現長出了一些原養(yǎng)型的菌落轉化細胞與細胞直接接觸

發(fā)生的遺傳物質交換和重組？

1950Davis設計了

U型管實驗菌株間交配系統(tǒng)？在任何一臂內都沒有出現原養(yǎng)型細菌,兩個菌株間的直接接觸—菌株間交配系統(tǒng)？Hayes（1952)試驗證明，在接合過程中遺傳物質的交換是一種單向的轉移：

供體donor

（雄性）→性別受體

receptor

（雌性）

接合：在原核生物中，是指遺傳物質從供體“雄性”轉移到受體“雌性”的過程。conjugation供體--F因子（sectorfactororfertilityfactor）

94.5kb2%1--3

感染性

F纖毛蛋白4個ISDNA組成F–F+Hfr附加體Episomes

（附加體）：plasmidsthatcanintegrateintohostchromosomeFfactorReplicatesinsidehostcellFfactorcontainsgenesencodingsynthesisofpiliwhichallowcellcontact接合現象性傘毛—接合管Fpilus--conjugationtube

F+細胞的F因子由接合管向F-傳遞，使F–受體變成F+細胞質橋F因子及其在雜交中的行為F因子及其在雜交中的行為Hfr

（highfrequecyrecombination）Hayes的實驗得到證實----分離到一種供體菌株

F–

各種不同染色體基因

重組子高（1000）為什么兩個細菌細胞的接和能實現染色體上基因重組A204.aviA205.avi外基因子(exogenote)受體細胞接受的部分供體染色體內基因子(endogenote)受體完整染色體部分二倍體(部分合子\半合子)單數交換單數交換偶數交換F–F+HfrF’Partialdiploid性導(sexduction):利用F’因子將供體細胞基因導入受體形成部分二倍體的過程.接合現象性傘毛—接合管Fpilus--conjugationtube

F+細胞的F因子由接合管向F-傳遞，使F–受體變成F+細胞質橋中斷雜交(interruptedmating)1954年F.Jacob和E.Wollman等開始進行對大腸桿菌染色體轉移的動力學研究，他們發(fā)現在Hfr×F―的接合過程中，線性染色體DNA是以恒定的速率由供體向受體移動，為繪制大腸桿菌的染色體圖提供了一個很有用的技術，即中斷雜交(interruptedmating)。Mutantselection中斷雜交試驗及染色體連鎖圖

interruptedmatingexperiment

雅各布(Jacob，F)和沃爾曼(Wollman，E.)在五十年代設計著名實驗菌株基因型：Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSF–:

thr–leu–aziStonSlac–gal-strR

Interruptedmatingexperiment

37營養(yǎng)用來研究細菌接合過程中基因轉移方式的實驗基本方法：1）接合中的細菌在不同時間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細菌（中斷雜交）；2）排除供體菌（donor：Hfr）：接種到含有鏈霉素（Str）的培養(yǎng)基上，抑制Hfr生長；同時：選擇標記，最好是最早轉入受體的基因。實驗材料：（蘇亮疊噬菌體T1乳糖半乳糖鏈霉素）Hfr:thr+

leu+azistonslac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonrlac－gal－strr3）排除未接合（未重組）的受體菌（recipient：F－）以某供體基因（如thr+）作為選擇標記，接種到相應的選擇性培養(yǎng)基（如缺乏threonine）上，抑制F－菌生長4）影印到其它各種選擇性培養(yǎng)基上，測定選擇標記基因進入受體F－菌后，其它非選擇性標記基因進入F―受體菌的順序和時間。

隨著時間的推移，具有某種非選擇性標記基因的菌落逐漸增加，達到一定頻率后處于一個穩(wěn)定的水平。某基因轉入的時間越早，它所達到的頻率越高，“選擇標記”基因與“非選擇標記基因”間同時重組的頻率越高，說明選擇標記基因與非選擇標記基因相距越近；反之，相距越遠。MappinggenesinHfrandF－crossesbyinterruptedmatingexperiments接合攪拌

排除Hfr（培養(yǎng)基Str）Hfr:thr+

leu+azistonslac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonrlac－gal－strr選擇標記排除未接合受體菌TheinterruptedmatingexperimentofWollmanandJacob.Hfr:thr+leu+azistons

lac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonr

lac－gal－strr中斷雜交作圖：根據中斷雜交試驗中供體基因進入受體所需時間作為基因間距離繪制連鎖圖的方法。圖距單位為分鐘。

Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSF–:

thr–leu–aziStonSlac–gal-strR重組子不含蘇氨酸t(yī)hr+

strR鏈霉素str的幾種不同培養(yǎng)基（篩）2minthr+8minleu+thr+leu+strR

selectedmarker

選擇標記selectedmedium

篩選培養(yǎng)基含鏈霉素不含蘇氨酸和亮氨酸Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSHfr非選擇標記基因進入F–所需時間

分鐘從Hfr

上轉移的基因909aziR

11aziR

tonR

18aziR

tonR

lac+

25aziR

tonR

lac+gal+

用不同的Hfr菌株進行中斷雜交實驗所作出的大腸

桿菌基因連鎖圖，其基因向F-細胞轉移的順序大不相同。F因子插入環(huán)狀染色體的不同位置形成不同轉移原點和轉移方向

大腸桿菌的遺傳圖是環(huán)形的如轉移時間小于2分鐘----傳統(tǒng)的重組作圖法(recombinationmapping)例如lac+(乳糖發(fā)酵)和ade–

(腺嘌呤缺陷型)

Hfr

lac+ade+×F–lac–ade–

完全培養(yǎng)基不加腺嘌呤選出F–

ade+的菌落（重組子）（對測定圖距沒有意義，有可能ade尚未進入）Hfrlac+ade+strs

×F―

lac–ade–strr

（根據中斷雜交試驗，已知lac和ade緊密連鎖，且lac先于ade進入F－。）基因的重組兩基因間的重組頻率是22%。1min約相當于20%的重組值ade轉化與作圖1、相鄰基因發(fā)生共轉化的概率與兩者間的距離呈正相關：基因間距離越近，發(fā)生共轉化的頻率越高，反之越低。2、可以通過測定兩個基因共同轉化的頻率來確定基因間的相對距離。F’因子與性導sexduction整合環(huán)出F′因子當發(fā)生環(huán)出時偶然不夠準確，攜帶有染色體的一些基因，稱這種F因子為F′因子。性導--sexduction接合時由F′因子所攜帶的外源DNA轉移到細菌染色體的過程。整合在一定的座位上且整合率高。F’plasmidformationandtransferFig.14.18a,b4.轉導(transduction)

Bacteriophage“Eaterofbacteria”inreality,killandlysebacterialcellssometimessimplycalled“phage”Twomajorpartsproteincoat(e.g.,head,tail)capsid(head)withDNAorRNATwodistinctphagegenotypescanbeanalyzedincrosses,allowingmappingtheviralgenomePhagecanbeusedtointroducegenesintobacterialcellsbytransductionAlsousedinrecombinantDNAtechnologyBacteriophage2．噬菌體的類型virulentphagetemperatephageTemperatephagecanintegrateintobacterialgenomethroughlysogeniccyclecreatingaprophage轉導的發(fā)現：1952年，J.Lederberg和他的學生N.Zinder在鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）中進行的重組實驗：1.菌株：StrainLT-2：phe+trp+met-his-StrainLT-22：phe-trp-met+his+將兩個沙門氏菌的營養(yǎng)缺陷型進行混合培養(yǎng)（雜交)

phe+

trp+

met-his-

StrainLT-2×

phe-

trp-

met+

his+StrainLT-22↓混合培養(yǎng)基本培養(yǎng)基↓菌落(頻率為1/105)

phe+trp+met+his+conjugationtransformationDNA酶原養(yǎng)型重組菌在LA-22

phe+

trp+

met-

his-

LT-2

phe-

trp-

met+

his+StrainLT-22大分子和病毒通過

過濾性因子(filterableFA)↓

Why?What?FA(不受DNA酶的影響)大小和質量與P22相同

沙門氏菌的一種溫和噬菌體P22穿過濾片野生型LT-22(+P22)P22少數偶然溶菌釋放P22感染LT-22LT-22重組感染LT-2偶然包裝LT-2基因P22P22Transduction：以噬菌體作為載體把一個細菌的遺傳物質轉移到另一個細菌細胞的過程，稱轉導.LT22菌株是攜帶P22噬菌體的溶源性細菌LT2菌株是對P22噬菌體敏感的非溶源性細菌；LT2DNA被裂解成小片段transducingphage再次進入LT22根據轉導的特點不同，轉導可分為：1）普遍性轉導（generalizedtransduction）

隨機轉導細菌的DNA片段。0.3%

2）局限性轉導（restrictedtransduction）

或稱特異性轉導（specializedtransduction）

指一些溫和噬菌體只能轉導細菌染色體基因組的某些基因，或者說只是對噬菌體在染色體基因組整合位點附近基因的轉導。TransductionGeneralizedtransduction（普遍性轉導）phageincorporatesrandomfragmentsofhostDNAfortransfertoanotherhoste.g.,phagesP1andP22,temperatephageswhichaccidentallystuffhostDNAintophageheadSpecializedtransduction（局限性轉導）specificgenesaretransferrede.g.,phagewhichtransducesonlyadjacentgenesFrequenciesofcotransductioncanbeusedtomapgenes;inverselyproportionaltodistance

Theformationofgeneralizedtransducingvirusesandthesubsequenttransductionofrecipientbacteria流產轉導GeneralizedtransductionSpecializedtransduction?2003JohnWileyandSonsPublishersRecombinationbetweenattsitesonthephageandbacterialchromosomesallowsintegrationoftheprophageFig.14.22bErrorsinprophageexcisionproduce

specializedtransducingphageAdjacentgenesareincludedincircularphageDNAthatformsafterexcisionFig.14.22cλdgal+侵染gal–菌株通過λ攜帶的gal+與受體基因gal–進行同源配對，經雙交換，產生重組的gal+轉導子，這種轉導子是非溶源性的，穩(wěn)定的。

λdgal+整合到受體染色體的gal–基因旁邊，不穩(wěn)定普遍性轉導與細菌作圖利用共轉導頻率來確定三個基因在染色體上排列順序共轉導的頻率越高，表明這兩個基因在染色體上的距離越近，連鎖越密切；相反，兩個基因的共轉導頻率越低，則說明兩基因間距離越遠。三因子轉導：E.coli

trpA+supC+pyrF+

作供體，trpA–supC–pyrF–

作受體，由P1轉導：trpA

代表與色氨酸（tryptophan）合成有關的基因；supC代表赭石突變抑制基因(ochre-suppressorgene)；pyrF代表與嘧啶(pyrimidine)生物合成有關的基因。最初選擇supC+轉導子，然后檢查supC+轉導子中其它兩個基因被轉導的情況，得到的轉導類型和數目如下：

①supC+trpA+pyrF+36②supC+trpA+pyrF–114③supC+trpA–pyrF+0④supC+trpA–pyrF–

453603Differentclassesofcrossovers:quadruplecrossoverisleastfrequentFig.14.17c從最少類型的轉導子③的基因型可看出：這三個基因的次序是supCtypApyrF，即typA位于中間。SupC+與trpA+共轉導頻率為：36+114∕603=0.25SupC+和pyrF+共轉導頻率為：36∕603=0.06

①supC+trpA+pyrF+36②supC+trpA+pyrF–114③supC+trpA–pyrF+0④supC+trpA–pyrF–

453603

應用中斷雜交技術、重組作圖、轉化和轉導相結合的方法已經得到細菌的非常詳細的染色體圖

RecombinationbetweenattsitesonthephageandbacterialchromosomesallowsintegrationoftheprophageFig.14.22bErrorsinprophageexcisionproduce

specializedtransducingphageAdjacentgenesareincludedincircularphageDNAthatformsafterexcisionFig.14.22cλdgal+侵染gal–菌株通過λ攜帶的gal+與受體基因gal–進行同源配對，經雙交換，產生重組的gal+轉導子，這種轉導子是非溶源性的，穩(wěn)定的。

λdgal+整合到受體染色體的gal–基因旁邊，不穩(wěn)定1946年第11屆冷泉港會議上Hershey和Luria宣布發(fā)現噬菌體r、h突變，Delbruck和Hershey發(fā)表了噬菌體重組實驗。三人獲1969年NobelPrize噬菌體突變影響生活周期，會產生不同的噬菌斑。可以通過觀察噬菌斑的形態(tài)來鑒別噬菌體的基因型。單個噬菌體的突變必須電鏡才能鑒定。噬菌體重組與作圖：（1）噬菌斑的形態(tài)：（2）宿主范圍：h-：噬菌體能在E.coliB和B/2品系上生長，在B和B/2

混合菌苔上產生透明斑。h+：只能在E.coliB品系上生長，在B和B/2混合菌苔

上產生半透明斑。Hershey使用的兩個表型特征：T2r-：快速溶菌，噬菌斑大，邊緣清楚。r+：噬菌斑小，邊緣模糊。B和B/2混合菌苔噬菌斑與基因型噬菌體雜交：1.親本噬菌體（T2）基因型：h-r+：透明，小斑，邊緣模糊。h+r-：半透明，大斑，邊緣清楚。2.雜交過程——混合感染實驗：兩個親本噬菌體混合感染E.coliB菌株，子代噬菌體通過感染B和B/2菌株，觀察菌苔上出現的噬菌斑特征，推斷子代噬菌體的基因型。（mixedinfectionexperiments）大半透明大透明小半透明小透明雜交結果：在B和B/2混合菌苔上出現了4種噬菌斑：噬菌斑表型推測基因型親本型透明小h-r+半透明大h+r-重組型半透明小h+r+透明大h-r-重組機理：h+r-h+r-h+r-h-r+h-r+h-r+h+r-h+r-h+r-h-

r+h-

r+h-

r+噬菌體染色體在細菌體內復制不同的噬菌體染色體在細菌體內交換重組h+r+h+r-h+r-h-

r+h-

r+h-r-h+r+h+r-h-r+h-r-釋放出4種子代噬菌體部分噬菌體DNA重組噬菌體重組值計算與基因作圖：1.重組值的計算：重組噬菌體的噬菌斑數總噬菌斑數×100%2.基因圖距：用兩個基因的重組值表示基因間的遺傳距離。（h+r+

+h-

r-

）totalplaques×100%Hershey和Rotman1949年的T2雜交結果基因型噬菌斑百分率h-

r+4276%h+r-34h+r+1224%h-

r-12rh24四種噬菌斑數及重組值雜交組合

每種基因型的%

重組值r–h+r+h–r+h+r–h–ra–h+

r+h–rb–h+

r+h–rc–h+×r+h–34.032.039.042.056.059.012.05.90.712.06.40.924%12.3%1.6%

ra–h+

r+h–

→24%

rb–h+

r