干擾素制備的工藝流程

干擾素的制備流程

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干擾素什么是干擾素?概念(interferon,IFN):機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)細(xì)胞因子,是機(jī)體受到病毒感染時(shí),免疫細(xì)胞通過(guò)抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類(lèi)似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個(gè)類(lèi)型。α干擾素又依其結(jié)構(gòu)分為α1b、α2a、α2b等亞型其區(qū)別在于個(gè)別氨基酸的差異上,早期干擾素是用病毒誘導(dǎo)人白血球產(chǎn)生的,產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴,不能滿足需要，,現(xiàn)在可利用基因工程技術(shù)并在大腸桿菌中發(fā)酵、表達(dá)來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分

基因工程菌的制備目的基因的分離

目的基因與克隆重組導(dǎo)入大腸桿菌K12克隆載體載體的體外重組

受體菌的培養(yǎng)從受體菌中獲取目的基因

及篩選重組質(zhì)粒

表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌

受體菌的篩選（表達(dá)性、穩(wěn)定性等檢測(cè)）工程菌本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分目的基因的分離與獲得重組體引入宿主細(xì)胞提取重組質(zhì)粒

質(zhì)粒DNA的純化目的基因與克隆載體進(jìn)行體外重組從大腸桿菌K12獲取目的基因?qū)χ亟M質(zhì)粒的檢測(cè)與目的基因提取目的基因與表達(dá)載體的組合與導(dǎo)入工藝流程本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分目的基因的分離與獲得設(shè)計(jì)合成干擾素基因的兩端引物(完全的),每條引物內(nèi)或5‘-端最好有內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。1有藥物誘導(dǎo)細(xì)胞,如佛波酯,使細(xì)胞表達(dá)干擾素升高。2破碎細(xì)胞,提取細(xì)胞總mRNA.345用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄,把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA以cDNA為模板、干擾素引物為引物,PCR,得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分

目的基因與克隆載體進(jìn)行體外重組1.提取載體(質(zhì)粒、病毒等),雙酶切,再

把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的

酶酶切,用連接酶連接2.連接完成后分離純化,測(cè)序,與原干擾

素序列比對(duì)。3.鑒定序列無(wú)誤后(無(wú)義突變也行),導(dǎo)

入受體細(xì)胞,篩選本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分重組體引入宿主細(xì)胞將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pBR322中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,重組的載體DNA分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,形成攜帶質(zhì)粒的菌株。本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分從大腸桿菌K12獲取目的基因由于質(zhì)粒重組時(shí)有3種基本方式,即:目的基因與克隆載體重組,目的基因片段與目的基因片段重組,克隆載體與克隆載體重組;另外重組過(guò)程可能會(huì)發(fā)生基因突變情況流程:步驟一:將細(xì)菌涂布到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),就可得到質(zhì)粒PBR322或重組質(zhì)粒的細(xì)菌單菌落。步驟二:步驟一獲得的每一個(gè)細(xì)菌單菌落標(biāo)記為a、b、c、d等,在每一個(gè)單菌落中挑取部分細(xì)菌轉(zhuǎn)涂到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上,不能生長(zhǎng)的是絕大部分含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌及少量可能發(fā)生突變的非重組質(zhì)粒的細(xì)菌單菌落。原因:因?yàn)镻BR322含有抗四環(huán)素基因,重組質(zhì)粒中目的基因插在抗四環(huán)素基因中,使其結(jié)構(gòu)破壞,失去抗四環(huán)素作用。本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分。

提取重組質(zhì)粒①1、對(duì)上一步獲得含目的基因的大腸桿菌在含有氯霉素的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)15h。培養(yǎng)時(shí)間:前人實(shí)驗(yàn)證實(shí)大腸桿菌K12生長(zhǎng)前6h為遲緩期,6~15.5h為對(duì)數(shù)增時(shí)期,15.5~19.5h為穩(wěn)定期,19.5h后為衰亡期。氯霉素:氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成,結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制,然而,松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制。2、細(xì)菌的收獲和裂解

1）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘,棄上清,敞開(kāi)離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。2）將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。STE0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.Cl(Ph8.0)1mmol/LEDTA(Ph8.0)

按步驟1）所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分3、堿裂解法1）將洗過(guò)的500ml培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[來(lái)自收獲細(xì)菌的步驟3]重懸于10ml(18ml)溶液Ⅰ中。溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(Ph8.0)10mmol/LEDTA(Ph8.0)

溶液Ⅰ可分批配制，在101bf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘，貯存于4℃。2）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/LTris.Cl(Ph8.0)]。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時(shí)，溶菌酶不能有效工作。3）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ：0.2molLNaOH(臨用前用10molL貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋)1%SDS

蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。提取重組質(zhì)粒②本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分提取重組質(zhì)粒③4）加15ml(20ml)用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。

溶液Ⅲ：5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml

所配制的的溶液對(duì)鉀是3mol/L,對(duì)乙酸跟是5mol/L。

封住瓶口，搖動(dòng)離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時(shí)應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、高分子量RNA和鉀-SDS-蛋白質(zhì)-膜復(fù)合物。5）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開(kāi)剎車(chē)而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊原因通常是由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分。6）上清過(guò)濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分提取重組質(zhì)粒④7)用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以5000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會(huì)生成了沉淀。8)小心倒掉上清,敞開(kāi)瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡,于室溫用70%乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。9)用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀.10)純化。

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分（一）聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒DNA1)將核酸溶液所得轉(zhuǎn)入15mlCorex管中，再加3ml用冰預(yù)冷的5mo1/LLiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于4℃下以10000轉(zhuǎn)/分離心I0分鐘。LiCI可沉淀高分子RNA。2)將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇，充分混勻，用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖)于室溫以10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，回收沉淀的核酸。3)小心去掉上清，敞開(kāi)管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70%乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開(kāi)管口并將管倒置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。4)用500μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀,將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/LNaCI，充分混合，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心5分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。

質(zhì)粒DNA的純化①本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分6)吸出上清，用400μlTE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽l次。7)將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積(約lml)乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒DNA。8)吸去上清，加200μl處于4℃以12000g離心2分鐘。9)吸去上清，敞開(kāi)管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后可見(jiàn)的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。10)用500μlTE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀釋[用TE(pH8.0)]后測(cè)量0D260,計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度(10D260=50μg質(zhì)粒DNA/ml),然后將DNA貯于一20℃質(zhì)粒DNA的純化②本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分對(duì)重組質(zhì)粒的檢測(cè)與目的基因提取目的基因獲取對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因與PBR322質(zhì)粒片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，由于目的基因與PBR322質(zhì)粒片段相對(duì)分子量不同，在電泳過(guò)程中產(chǎn)生不同的條帶，通過(guò)與已知基因長(zhǎng)度的對(duì)比，我們可以選出相應(yīng)的目的基因，接著利用Qiagen純化柱回收純化DNA。具體：用3倍體積的特殊高鹽溶液于55°融化帶有目的基因的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，將DNA釋放到水溶液中。然后將其通過(guò)Qiagen純化柱，經(jīng)過(guò)”結(jié)合一洗滌一洗脫”步驟，直接得到純化的DNA樣品。利用核酸探針雜交法鑒定目的基因

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分目的基因與表達(dá)載體的組合與導(dǎo)入表達(dá)載體：PBV220，將PBV220和目的基因用雙酶切法處理，退火后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用CaCl2法導(dǎo)入到宿主大腸桿菌中，構(gòu)建工程菌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用干擾素性質(zhì)鑒定目的工程菌，分離工程菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取出質(zhì)粒，分析質(zhì)粒穩(wěn)定性。

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分干擾素的發(fā)酵工藝過(guò)程

啟開(kāi)種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提

精提半成品制備半成品鑒定分裝

凍干成品檢定成品包裝本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分l.菌種制備取一70℃下保存的甘油管菌種(工作種子批),于室溫下融化,然后，接入搖瓶,培養(yǎng)溫度30℃,pH7.0，250r/min活化培養(yǎng)18±2小時(shí)后,進(jìn)行吸光值測(cè)定和發(fā)酵液雜菌檢查。2.種子罐培養(yǎng)將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%,培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3-4小時(shí)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時(shí)取樣發(fā)酵液進(jìn)行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。3.發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%,培養(yǎng)溫度30℃,pH7.0。級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%,培養(yǎng)4小時(shí)。然后控制培養(yǎng)溫度20℃，pH6.0,溶解氧60%,繼續(xù)培養(yǎng)5-6.5小吋。同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液雜菌檢查，當(dāng)0D值達(dá)9.0±1.0后，用5℃冷卻水快速降溫至15℃以下，以減緩細(xì)胞衰老。或者將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10℃以下。4.菌體收集將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min離心收集。進(jìn)行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項(xiàng)目的檢測(cè)。菌體于一20℃冰柜中保存時(shí)，不得超過(guò)12個(gè)月。每保存3個(gè)月，檢查一次活性。

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分干擾素發(fā)酵過(guò)程控制在假單孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)中，菌體在培養(yǎng)1.5小時(shí)分裂速度最快，到3.5小時(shí)開(kāi)始下降。而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3.5小時(shí)之后，在4小時(shí)達(dá)到最大，然后由于降解而迅速下降?？梢?jiàn)在發(fā)酵生產(chǎn)工藝中，假單孢桿菌的生長(zhǎng)和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)，可采用兩段培養(yǎng)的策略進(jìn)行過(guò)程控制。

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分(l)溶解氧控制分別在生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段采用各自最佳溶解氧濃度，以期提高干擾素的發(fā)酵水平。通過(guò)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速得以實(shí)現(xiàn)。(2).溫度控制假單孢桿菌生長(zhǎng)最適溫度與產(chǎn)物形成最適溫度是不同的。產(chǎn)物合成溫度控制在20℃可以有效防止干擾素-α2b的降解，而其最佳生長(zhǎng)溫度則為30℃。質(zhì)粒的穩(wěn)定性隨溫度的升高而迅速下降，因此在培養(yǎng)后期降溫可以減少目標(biāo)產(chǎn)物的降解，增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性。(3).pH值發(fā)酵過(guò)程中，pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定。干擾素-α的等電點(diǎn)在pH6.0附近，在低酸性條件下穩(wěn)定，能耐受pH2.5的酸性環(huán)境。因此可在發(fā)酵后期降低pH,從而造成大量蛋白酶失活減少干擾素-α的水解，提高干擾素的積累量。

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分半成品檢定(l)效價(jià)測(cè)定用細(xì)胞病變抑制法，以Wish細(xì)胞VSV病毒為基本檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定中必須用國(guó)家或國(guó)際參考品校準(zhǔn)為國(guó)際單位。(2)蛋白質(zhì)含量測(cè)定福林-酚法，以中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。(3)比活性效價(jià)的國(guó)際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。(4)純度電泳純度用非還原型SDS法，銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測(cè)定純度應(yīng)在95%以上。(5)相對(duì)分子量測(cè)定還原型SDS,加樣量不低于微克，同時(shí)用已知相對(duì)分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列做對(duì)照，以遷移率為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算相對(duì)分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分(6)殘余外源性DNA含量測(cè)定用放射性核素或生物素探針?lè)y(cè)定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg.(7)殘余血清lgG含量測(cè)定在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法吋必須進(jìn)行此項(xiàng)檢定。(8)殘余抗生素活性測(cè)定半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在。(9)紫外光譜掃描檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應(yīng)在280±2納米。(10)肽圖測(cè)定用CNBr裂解法，測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應(yīng)一致。(11)等電點(diǎn)測(cè)定等電聚焦電泳。(12)除菌半成品應(yīng)做干擾素效價(jià)測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)和熱源質(zhì)試驗(yàn).

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分成品檢定(1)物理性狀

凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見(jiàn)不溶物。(2)鑒別試驗(yàn)

應(yīng)用ELISA或中和試驗(yàn)檢定。(3)水分測(cè)定

用卡氏法，應(yīng)低于3%。(4)無(wú)菌試驗(yàn)

同半成品。(5)熱原質(zhì)試驗(yàn)

同半成品檢定。(6)干擾素效價(jià)測(cè)定

同半成品檢定，效價(jià)不應(yīng)低于標(biāo)示量。(7)安全試驗(yàn)體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無(wú)紅腫、壞死、總體重不下降，說(shuō)明成品合格。取體重18-20克小鼠5只，每只尾靜脈注劑量按人每千克臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若動(dòng)物全部存活，說(shuō)明成品合格。

本文檔共27頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期二\13點(diǎn)24分問(wèn)題討論1.目的基因的獲取為什