儀器分析色譜法的基本原理

關于儀器分析色譜法的基本原理第1頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三本章基本要求⒈理解混合物中各組分在色譜柱內分離的原因；⒉了解色譜流出曲線和術語；⒊理解柱效率的物理意義及計算方法；⒋理解速率理論方程對實際分離的指導意義；⒌掌握分離度的計算方法及影響分離度的色譜參數(shù)。第2頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三2.1

概述2.1.1

色譜法發(fā)展史色譜法是俄國植物學家Tswett（茨維特）于1903年首先提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根裝有固體碳酸鈣顆粒（固定相）的豎直玻璃管（色譜柱）中，并再從管的上部加入純的石油醚（流動相），任其自由流下。這時植物色素的抽提液沿玻璃管流動，在管內形成具有不同顏色的色帶，每個色帶代表不同的組分。

--------“色譜”（色層）因而得名第3頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三胡蘿卜素（橙色）植物色素葉綠素（綠色）葉黃素（黃色）石油醚CaCO3固定相1941年，Martin、Syuge發(fā)明了液－液色譜。1952年，James、Martin發(fā)明了氣相色譜。20世紀60年代，出現(xiàn)了高效液相色譜。第4頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三⑴色譜法：借助在兩相間分配系數(shù)的差異，而使混合物中各組分獲得分離的技術稱為色譜分離技術。⑵固定相：填充柱內的填料（固體或液體）。⑶流動相：攜帶樣品流過固定相(氣體、液體和超臨界流體)。⑷色譜柱：裝有固定相的柱。色譜分離過程：當流動相中攜帶混合物經過固定相時，與固定相發(fā)生作用，由于各組分的結構性質（溶解度、極性、蒸汽壓和吸附能力等）不同，這種相互作用產生強弱的差異。在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，按先后不同的次序從固定相中流出。幾個基本術語：第5頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

氣相色譜

--------用氣體作流動相

液相色譜

--------用液體作流動相由于固定相可分為固體吸附劑和涂在固體擔體上或毛細管內壁上的液體固定相，故可將色譜法分為下述四類：

氣–固色譜氣體固體

流動相固定相

液體液體

1、按兩相所處的狀態(tài)分類液-固色譜氣-液色譜液–液色譜2.1.2色譜法分類第6頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三①柱色譜：固定相裝在柱管內。它又可分為填充柱色譜和毛細管柱色譜。固定相裝在色譜柱（玻璃管或毛細管）內。②紙色譜：用濾紙作固定相或載體，把試樣液體滴在濾紙上，用溶劑將它展開，根據其在紙上有色斑點的位置與大小，進行鑒定與定量測定。③薄層色譜：將固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。樣品的分離形式類似紙色譜。2、按固定相形狀分類第7頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三①

吸附色譜（L-S，G-S）：利用吸附劑對不同組分物理吸附性能的差異進行分離。

②

分配色譜（L-L，G-L）：利用不同組分在兩相中分配系數(shù)的不同進行分離。在液-液分配色譜中，根據流動相和固定相相對極性不同，又分為正相分配色譜和反向分配色譜。③

離子交換色譜（L-S）：利用組分離子與離子交換劑的交換能力不同進行分離。④

空間排阻色譜（凝膠色譜法，L-S）：用多孔物質對不同大小分子的阻礙作用進行分離。固定相是一種分子篩或凝膠，利用各組分的分子體積大小不同而進行分離的方法。⑤親和色譜：利用不同組分與固定相的高專屬性親合力進行分離的技術，常用于蛋白質的分離。3、按分離過程的物理化學原理分類第8頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三色譜法的分類大致如下：

根據以上所述，將色譜法的分類總結于下表中：第9頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三2.2色譜分離原理2.2.1分配系數(shù)和分配比分配系數(shù)：分配比k（又稱容量因子）定義：在一定的溫度、壓力下，組分在氣–液兩相間達平衡時，分配在液相中的重量與分配在氣相中的重量之比。即s：固定相m：流動相k

隨柱溫、柱壓、相體積變化，由組分及固定液的熱力學性質決定β：相比第10頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三進樣A＋B＋空氣BAA+B流動相BBA流動相固定相檢測和紀錄2.2.2分離原理例：氣相色譜法——載氣（即流動相，是一種不與待測物作用、用來載送試樣的惰性氣體，如氮氣等）載著待分離的試樣通過色譜柱中的固定相，使試樣在兩相中發(fā)生反復多次的分配，最后使各組分分離，然后分別檢測，記錄各自的響應信號。第11頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三2.3色譜流出曲線色譜流出曲線（色譜圖）即色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為信號強度，橫坐標為保留時間。峰高←色譜峰保留時間（分）響應值第12頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1、有關術語①基線：柱中僅有流動相通過時，檢測器響應訊號的記錄值，即圖中O-t線。穩(wěn)定的基線應該是一條水平直線。②峰高：色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，h③標準偏差④峰面積A⑤半峰寬Y1/2

=2.354⑥峰底寬Y=4、Y1/2、Y：區(qū)域寬度第14頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三死時間tm:

不被固定相吸附或溶解的組分進入色譜柱時，從進樣到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需的時間。對于氣相色譜，常把空氣(TCD)和甲烷(FID)從進樣到出峰的時間稱為tm。如圖中O-A’。這種物質不被固定相吸附或溶解，其流速與流動相的流速接近。測定流動相平均線速度ū時可用柱長L與死時間tm

的比值計算。2、保留值第15頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三保留時間tR

試樣從進樣開始到柱后出現(xiàn)色譜峰極大值所需要時間。如圖中O-B。它相應于樣品到達檢測器所需的時間。

tR=tR′+tm調整保留時間tR′

扣除死時間后的組份保留時間，即

tR′=tR

tm

組分在色譜柱中的保留時間tR包含了組分隨流動相通過柱子所需的時間和組分在固定相中滯留的時間；tR′實際上是組分在固定相中滯留的時間。單位(s)或(cm)。第16頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三死體積Vm

不能被固定相滯留的（惰性）組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值時所消耗的流動相的體積。死體積可由死時間與流動相體積流速F0（L／min）計算：

Vm=tm·F0保留體積VR

從進樣開始到柱后被測組份出現(xiàn)濃度最大值時所通過的流動相體積。如下：

VR=tR·F0第17頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三調整保留體積VR′

某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調整保留體積

VR′=tR′·F0

或VR′=VR-Vm相對保留值α2,1

某組份2與組份1的調整保留值之比，是一個無因次量。α2,1的大小與兩組分的選擇性有關。α2,1越大，選擇性越好，越容易分離。α2,1只與柱溫及固定相的性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關。因此是色譜法中，特別是氣相色譜法中廣泛使用的定性數(shù)據。第18頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

從色譜流出曲線上，可以得到許多重要信息：①根據色譜峰個數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個數(shù)。②根據色譜峰的保留值（或位置），可以進行定性分析。③根據色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析。④色譜峰的保留值及其區(qū)域寬度，是評價色譜柱分離效能的依據。⑤色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據。第19頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三在自然科學上，科學理論：假設理論模型(數(shù)學表達式)實驗驗證修改模型完善1.塔板理論假設①在每塊塔板上氣液平衡是瞬間建立的。②載氣以脈沖式(塞子式)進入色譜柱進行沖洗，每次恰好為一個塔板體積。③所有組分開始都加在第零號塔板上，且不考慮沿色譜柱方向的縱向擴散。④在所有塔板上同一組分的分配系數(shù)是常數(shù)，和組分的量無關。⑤柱分成幾段，n為理論塔板數(shù)，每段高為H，柱長為L，n=L/H。2.4塔板理論第20頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三假定：K=1Vs/Vm=1k=1n=5進樣量w=10.50.50.250.250.250.250.1250.250.1250.12550.250.1250.06250.1880.1880.06250.06250.1880.1880.06250.031250.1250.1880.1250.031250.031250.1250.1880.1250.03125w=1μg1ΔV2ΔV3ΔV4ΔV①分布有一最大，兩邊逐漸減小②最大及整個分布曲線向后推移③流出曲線方程（塔板理論方程）在此檢測得到位移隨時間變化曲線第21頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三這一理論得到結果：

1．分布有一最大，兩邊逐漸減小；

2．最大及整個分布曲線向后推移；

3．流出曲線方程(也稱塔板理論方程)，即數(shù)學表達式：C：不同流出體積時的組分濃度m：進樣量VR：保留體積N：塔板數(shù)V

：流出體積SV(t,x)被測物流出色譜柱時流動相中被測物濃度隨體積(或時間)的變化曲線：第22頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三在氣相色譜柱內，理論塔板數(shù)一般達103～106。塔板數(shù)越多，其流出曲線越接近于正態(tài)分布。根據塔板理論可以導出N

與色譜峰半寬度或峰底寬度的關系：理論塔板高度H：色譜峰W

越小，N

越大，H

越小，柱效能越高。因此，N

和H

是描述柱效能的指標。在實際工作中，計算出來的N

和H

值時,有時并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因為用tR計算時，沒有扣除死時間tm，應予扣除。所以用tR′代替tR計算出來的N

值稱為有效理論塔板數(shù)Neff。

第23頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三為了準確評價色譜柱效能，宜采用有效塔板數(shù)Neff和有效塔板高度Heff。有效塔板數(shù)Neff和有效塔板高度Heff消除了死體積影響，較真實的反映了色譜柱的好壞。

有效塔板高度：根據tR′=tR-tm，k=

tR′/tm，tR=tm(1+k)，可得第24頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三⒉塔板理論的成功與局限⑴成功①導出流出曲線數(shù)學表達式(模型)；②解釋了流出曲線形狀、濃度極大點；③提出了評價柱效的參數(shù)(N)及其計算公式。⑵局限①僅考慮了熱力學因素，沒有考慮動力學因素；②不能說明影響柱效的原因及譜帶擴張的原理；③不能說明流速對柱效的影響，實驗測得流速不同時N和H不同。速率理論第25頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

2.5速率理論1956年荷蘭化學家VanDeemter等在研究氣-液色譜時，討論擴散傳質等與色譜過程物料平衡和質量平衡的關系，考察溶質通過色譜體系總濃度的變化。他提出了色譜過程動力學理論—速率理論。隨后Giddings吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質過程，認為把色譜過程看作分子無規(guī)則運動的隨機過程，從而在動力學基礎上較好地解釋了影響板高的各種因素。第26頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

該理論模型對氣相、液相色譜都適用。

VanDeemter方程的數(shù)學簡化式為:式中：u為流動相的線速度；A，B，C為常數(shù)A——渦流擴散項系數(shù)B——縱向分子擴散項系數(shù)C——傳質阻力項系數(shù)（C

＝C

s＋C

m)。其中C

s：固定相傳質阻力項系數(shù)；C

m：流動相傳質阻力項系數(shù)。第27頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

A=2λdP

λ填充不規(guī)則因子

dP

填充物顆粒的平均直徑。影響A的因素：填充物顆粒大小dP和填充均勻性λ(取決于填充物顆粒的大小分布和裝柱情況）有關,與載氣性質、線速和組分無關。減小渦流擴散提高柱效的有效途徑：使用適當?shù)牧６惹翌w粒均勻的擔體，并盡量填充均勻。AB渦流擴散項A第28頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三分子擴散項B/u

B=2Dg

固定相填充在柱內后使氣體擴散路徑變彎曲的因素.Dg組分在氣相中的擴散系數(shù)（cm2/s）。填充柱γ=0.5-0.7毛細管柱γ=1.0分子量大的組分Dg小，Dg反比于載氣密度（分子量）的平方根,故采用分子量較大的載氣可使B項降低。保留時間長,分子擴散項對色譜峰變寬的影響顯著.第29頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三Cgu

--氣相傳質阻力項；Cg--氣相傳質阻力系數(shù);Clu--液相傳質阻力項；Cl--液相傳質阻力系數(shù)傳質阻力項Cu Cu=Cgu+Clu＝(Cg+Cl)u

氣相傳質過程：氣相傳質阻力項與填充物粒度的平方成正比，與組分在載氣流中的擴散系數(shù)成反比，因此采用粒度小的填充物和分子量小的氣體作載氣可提高柱效。液相傳質過程：減小液膜厚度，增大組分在液相中的擴散系數(shù)，均可提高柱效。第30頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三⒉速率理論的要點⑴被分離組分分子在色譜柱內運行的多路徑、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質阻力使氣-液兩相間分配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展、柱效下降的主要原因。⑵通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。⑶速率理論為色譜分離和操作條件的選擇提供了理論指導，闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。⑷各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質，但又加劇了分子擴散的影響。因此，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。第31頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

速率理論液相色譜法（P19）第32頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三2.6分離度一、定義分離度是兩色譜峰分離的程度。圖中：a）兩色譜峰距離近并且峰形寬。兩峰嚴重相疊，表示選擇性和柱效都很差。b）兩峰距離拉開，但峰形仍很寬，說明選擇性好，但柱效低。c）分離最理想，說明選擇性好，柱效也高。第33頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三tR（2），tR（1）：兩組分保留時間Y1，Y2：兩組分色譜峰峰底寬度分離度Rs單獨用柱效或選擇性不能真實反映組分在色譜柱中分離情況，故需引入一個綜合性指標。分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標，稱總分離效能指標。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值。第34頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三同一色譜柱在相同條件下，不同組分可有不同的Rs值。若峰形對稱且滿足正態(tài)分布條件，當Rs=1時，分離程度可達到98%；Rs=1.5時，分離程度可達到99.7%，通常用Rs=1.5作為相鄰兩色譜峰完全分開的標志。兩個相鄰組分達到完全分離的條件：（1）兩色譜峰間有一定距離；（2）兩色譜峰寬必須窄。Rs=0.75Rs=1.0Rs=1.5第35頁，講稿