定量蛋白組學(xué)

定量蛋白組學(xué)：應(yīng)用SILAC〔穩(wěn)定同位素標記法〕爭論和厚樸酚治療肝癌細胞HepG2定量蛋白組學(xué)：應(yīng)用SILAC(穩(wěn)定同位素標記法)爭論和厚樸酚治療肝癌細胞HepG2和厚樸酚是植物厚樸中主要的活性成分之一ClsHl80，其構(gòu)造式見Fig．2．1。有爭論認為賜予厚樸酚對背部皮下移植及右厚樸酚對細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的影響時覺察，添加100üM厚樸酚凋亡伴有caspasc活性增加，從而提示是caspas~依靠性途徑。上述結(jié)著顯示細胞毒性作用。濃度為loopg／mL時顯著抑制HT-1080趨3．36％和3l％n[14-17]。國HL260細胞和白血病JurkatT覺察caspase-3caspase-2抑制劑減弱，另外覺察胞漿細胞色素C[18]RKO細胞的凋亡SVK血管肉瘤細胞也表現(xiàn)出誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。2023年的一項爭論覺察：BcI-XL的下調(diào)，線粒體細胞色素C的釋放和caspase-3的活化都參與了和厚樸酚在人的鱗癌細胞CH27中引起的凋亡過程。我們知道肝纖維化治療的目標就是期望能夠逆轉(zhuǎn)纖維化，并且通過誘導(dǎo)細胞凋亡選擇性地去除活化了的星形細胞。Park]厚樸酚能夠誘導(dǎo)鼠活化的星形細胞凋亡Battl~等的爭論也證明對于B細胞性慢性亡Hib~sAmiMolt-4B細胞用和厚樸酚進展治療可以產(chǎn)生生長抑制和誘導(dǎo)細胞凋亡變。Fig.2.1而發(fā)生的轉(zhuǎn)變[1]。通過了解這些功能活動變化的過程，或許可以提醒[2過去，主要承受二維差異凝膠電泳(DIGE)技術(shù)分析蛋白質(zhì)的差異表達。近年來進展起來的一種穩(wěn)定同位素標記(Stable~sotopeLabeling)質(zhì)譜分析技術(shù)，因其使用穩(wěn)定同位素標記，使得質(zhì)譜檢[3-7]。2H1C、15N1O)的試劑標記與被分析肽段一樣的肽段作為其內(nèi)標物，被分析肽段則與正常的同種試劑(即其中全部元素的含量皆為自然豐度)結(jié)定。目前，各種不同的穩(wěn)定同位素應(yīng)用范圍極廣[8。1999cygi等建立了同位素親和標簽(isotope-codedaffinitylag，ICAT)技術(shù)，為進展定量蛋白質(zhì)組學(xué)供給了一個寬闊的空間，ICAT試劑由3局部組成，既特異結(jié)合肽段中半胱氨酸殘基(biotin劑分為28個氘原子，D8)8DO8個氘原子與8個氫原子分別標記的ICAT質(zhì)量正好相差80a。ICAT技術(shù)在定量蛋白組學(xué)半胱氨酸的蛋白質(zhì)；其次，ICAT500Da)在整個MS中性72個多肽相差8、含有216時與氧化很難區(qū)分，對定量和鑒定都帶來難度；第四，一般ICAT定量的誤差在200以內(nèi)，但假設(shè)樣品成分簡單，定量誤差會增大，并往往需要手工檢查結(jié)果：第五，這種方法要獲得完整的信息，最重要的是標記必需是特異效率是時間依靠性的，很少能到達80％以上?，F(xiàn)在國外有很多報道另外一種定量蛋白組學(xué)的方法 n耵：SILAC(stableisotopelabe~ingbyaminoacidsincellculture)。碼子。此方法有很多優(yōu)點：第一，SILAC不像ICAT有化學(xué)標記的參與；其次，SILAC省去了親和純化這一簡單的工作；第三，SILAC適用SILAC操作比較便利，并且相比照較廉價。Fig.2.2SILAICAT國內(nèi)外對和厚樸酚爭論比較多做了大量的爭論，SILAC技術(shù)與質(zhì)譜結(jié)合是一個很好的定量蛋白方法。本文用和厚樸酚作用于亮氨酸一d3HepG213-aetine蛋白為標準(由于13-actine是高度保守蛋白，不會被藥物調(diào)控)，通過定量蛋白組學(xué)方法，確定出和厚樸酚調(diào)控的蛋白，根據(jù)蛋白功能及相關(guān)作用，找出和厚樸酚作用于癌細胞的作用機理。試驗材料2-2-1人肝癌細胞株HepG2由本試驗室供給。試劑和材料Sigma公司胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Tyrisin)：均購自美國GibieoBRL蛋白酶抑制劑(ProteaseInhibitorCocktailforusewithmammalioncallandtissueextracts)．購自Sigma-Aldrichmarker)：購MBIFerment,as公司。十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甘氨酸(Glycine)、19250(Coomassiebrilliantblue(3250)、DTT(二硫蘇糖醇)：均購自美國Bio-Rad培育基用抗生素：青霉素、鏈霉素為國產(chǎn)注射用藥。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。試驗儀器和設(shè)備AllegraTM25RCnatrifugBECKMANCOULTE超低溫冰箱：MDF-792，SAra”O(jiān)(-80”c)。恒溫培育箱：CChlncubator，SANYO。高壓滅菌鍋：LaboAutoelave，SANYO。SANYO。倒置顯微鏡：CK2，Olympus。一般光學(xué)顯微鏡：CH-2，Olympus。pHDELTA320pHmeter，METTLERTOLEDO。電子天平：PL2023，AB265-S，METTLERTOLEDO。。脫色搖床：WD．9405B，北京市六一儀器廠。質(zhì)譜儀：Waters-Q-TOF。試驗方法：試驗流程圖：Fig.2.3Fig.2.3試驗流程圖試劑配置細胞培育所需溶液的配制〔1〕細胞培育基：DMEM培育其按產(chǎn)品說明，常規(guī)過濾除菌后，參加抗生素：青霉素100U／ml，鏈霉素100U／ml，4“C細胞保種液：DMSO(FBSl：920℃保存。0．25％胰酶消化液：0．25g胰酶溶解于100ml同時還可參加EDTA存。SDS-WesternblotTris25mmolLTrisbase192mmoFLSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5％積層膠(2m1)：蒸餾水1．4ml，30％丙烯酰胺溶液O．33ml，1.0mol／LTris(pH6．8)0．25ml，10％SDSO．02ml，10％過硫酸銨O．02ml，TEMED0．002ml。SDS12％分別膠(7．5m1)：蒸餾水2．45ml，30％丙烯酰胺溶液3m1，1．5moFLTris(1pH8．8)1．95ml，10％SDS0．075ml，10％過硫酸銨0．075ml，TEIVIED0．003ml。(439mmoFL48mmoLTrisbase003％SDS(電泳級)，20％甲醇。(PBS)：137mmoFLNaCl，2．7mmoFLKCI，10mmoI／LNa2HP04，2m1110FLKH2P04，蒸餾水配制，用HCl調(diào)整溶液的pH7．4，保存于室溫。PBST：含O．05％Tween20PBS。2~SDS100mmoFLTris·CI(PH6.8)，200mmoFL二硫蘇糖醇(DTT)，40／oSDS(電泳級)，O．2％溴酚藍，20％甘油。封閉液：5g脫脂牛奶溶解于100mlPBST兒強s·C1~pH9．5)，置于密閉容器室溫保存。BCIP：50mgBCIP溶解于lml蒸餾水中，避光保存于4℃。(11)NBT：75mgNBT溶解于70％DMF(二甲基甲酰胺)lml光保存于4℃。生色底物混合液：75mg／mlNBT80gl，50mg／mlBCIP60ǖl20ml30考馬斯亮藍染液：45ml45ml10ml0．25gG250(14)0．02％Na2S203：20mgNa2S203溶解于100ml去離子水中，穎配制。去離子水后，再參加100ül40％甲醛混勻即可，最好穎配制。HepG2從液氮罐中快速取出裝有HepG2的凍存管，讓HepG2能快速通過對細胞有損害的．50“C～0“C馬上將凍存管放置于37℃恒溫水浴箱中，搖動凍存管，使其20-60sec在超凈工作臺中翻開凍存管，將細胞懸液用巴氏吸管吸出到無菌的離心管中，參加2mlDMEM2023g，3min。2ml培育基重懸細胞，將細胞懸液接種到250ml的玻璃培育瓶中，參加穎DMEM培育基15ml37℃C02孵箱中培育。培育24h，待大局部細胞貼壁后，更換穎的培育基連續(xù)培養(yǎng)。細胞計數(shù)制備細胞懸液：傾去培育基，用0．25％胰酶消化液消化并／ml。用吸管吸取少量細胞懸液，滴在計數(shù)室邊緣的斜面上，讓細液注入量不要過多或過少，計數(shù)室內(nèi)不應(yīng)有氣泡產(chǎn)生。(10×物鏡)，計數(shù)4個大格中的細胞數(shù)。如細胞壓在格線上時，則數(shù)上不數(shù)下不數(shù)右。(44)104HepG2取一瓶HepG2細胞，倒置顯微鏡下觀看，如細胞已長成致密單層，即可進展細胞傳代。l～2ml0．25％胰酶消化液，轉(zhuǎn)動培育瓶，使其浸潤整個細胞層，置室溫下消化3～5min。倒置顯微鏡下觀看細胞，當細胞由長梭形收縮變?yōu)閳A形，細胞之間消滅間隙，并且可見有細胞漂移到培育液中時，可以終止現(xiàn)針孔大小空隙時，即可終止消化。參加2～3ml培育基于培育瓶中終止消化，吸取瓶中培育液混勻，將細胞懸液吸取到無菌離心管中，室溫，2023g，離心3min。(4)棄上清．參加4ml2×106／mt)，lml接種到1250ml15ml3712C02孵箱中培育。4～51倒去細胞培育液于廢液缸中，參加l～2ml0．25％胰酶消化液進展消化，制備成細胞懸液。2023，離心3mi棄上清，加2ml5×106／m1)。再將細胞懸液分裝到兩個消毒的凍存管中，每個lml，蓋緊管蓋，并做好標記o先將凍存管置于4℃冰箱4h，然后移入液氮罐的氣相液氮中放置lh(-196℃)中凍存(這樣能獲得較高的復(fù)蘇率)。HepG2用刮取的方法收集生殖期與維持期的Hep02用PBS或者生理鹽水清洗2～3次，留適量液體于瓶內(nèi)，然后用特制的細胞刮棒朝一個方向刮取細胞并用生理鹽水將殘留于瓶內(nèi)的細胞洗下。將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，2023g，離心3min。-80“C備用。MTT黃色的噻唑蘭，簡稱MTT，可透過細胞膜進入細胞內(nèi)，活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT復(fù)原犯難溶于水的藍紫色的針狀Formazzn(DMSO)溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490mim．波特長測定其光吸取值，可間接反映細胞數(shù)量。試驗步驟：收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，分于96孔板，每孔180ü1，3000—1000037℃、5％C026—24參加不同和厚樸酚量，培育12—36小時。留神吸去上清80ü1穎DMEM20ulMTF溶液(5mg／m1，0.5％MTT)，連續(xù)培育4h。然后吸掉上清，每孔參加150u1二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min490呦處測量各孔的吸光值。MTTMTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定3復(fù)孔。計算抑制率=[(比照一空白)一(給藥一空白)]／(比照一空白)X100％。流式細胞檢測細胞凋亡及周期用適量的和厚樸酚治療Hep02細胞，在適當?shù)臅r間收集細胞檢測。(1)將細胞懸液和訪瓶內(nèi)的細胞1-2x106收集到離心管中。(2)用PBS(PH=7．2)300g離心5清夜。(3)將細胞放置于2-3ml冷70％乙醇中，混勻，保存于4℃。(4)上機檢測。細胞裂解與樣品制備n町選用RIPA裂解體系，使用前4“C預(yù)冷。取出收集好的HepG2細胞，按8mg／ml的濃度參加RIPA裂解液，同時參加蛋白酶抑制劑(PMSF)20(t07個細胞總蛋白≈1．0mg)125mRIPA裂解液，cocktail)2m。裂解體系冰上放置30～40min。6次，每次10~20sec，中間間隔10-20sec，低溫(4℃)下進展。裂解混合物于4℃，15,000r／min，離心15min，認真吸取上清液于另一1..5mI離心管(El”管)中，冰上放置。參加與上清液等體積的2xSDS凝膠加樣緩沖液，沸水中煮樣3～5min，即可進展SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，或者-80℃保存?zhèn)溆谩?1Bio-Rad配制好12％lcm)。用微量移液器留神地在丙烯酰胺溶液上掩蓋一層去離子水或飽和正丁醇。將凝膠垂直放置于室溫下。min)，傾去掩蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部2～3次以除去未聚合的丙烯酰胺，盡可能捧去凝膠上的液體，再用濾紙吸凈殘留液體。配制好5％的積層膠溶液，在已聚合的分別膠上直接灌注積層膠，馬上在積層膠溶液中插入干凈的梳子，留神避開混入氣泡，將凝膠垂直放置于室溫下。電泳裝置上，上、下槽各參加Tris-甘氨酸電泳緩沖液。加樣與電泳將制備好的樣品按每個加樣槽20山的量進展加樣，留神緩慢、均勻地將樣品加到加樣槽中，不行過快及用力過大槽中溢出。將電泳裝置與電源相接，80V電泳15min后，溴酚藍前沿進入分別膠，再把電壓提高到120V，連續(xù)電泳直至溴酚藍到達分別膠2h)，關(guān)閉電源。卸下玻璃板，用撥膠片撬開玻璃板，在凝膠下部切去一角以標注凝膠的方位。1DSDS．(SDS(1)SDS凝膠制好后，開頭加樣。加樣挨次依次為：蛋白質(zhì)分子量標準品，正常比照免疫沉淀樣品，卵巢癌患者免疫沉淀樣品；加樣量均為20gl。其余全部不用的樣品孔中加上等體積的lxSDS凝膠加樣緩沖液。5山，在做銀染時取1ul，剩余的體積由lxSDS開頭電泳，80V電泳15min后，提高電壓到120V，連續(xù)電泳2h)。凝膠考馬斯亮藍染色(G250染液中，放在平緩搖動的搖床上，室溫，染色過夜。其次天將凝膠浸泡在去離子水中脫色，染液回收備用。室溫4～8h或者脫色過夜，其間要更換去離子水3～4次。脫色凈。掃描己染色的凝膠，保存結(jié)果，并分析比較正常比照免疫沉處理與分析。質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析膏白條帶的切取和保存用去離子水漂洗膠2次，并用色譜純甲醇和去離子水沖洗1．5ml(EP使用無菌手術(shù)刀片，沿著差異條帶的邊緣，留神認真準確地將蛋白條帶切割下來，放入EP在EP管中將蛋白條帶切成約lmm3子水漂洗2EP-80℃保存。留意事項：盡量避開皮膚和頭發(fā)的角蛋白污染，在操作過程中應(yīng)戴一次性的PE不要將膠長時間存放于乙酸溶液中。EPWesternblotcaseinBSA2．3．11．2(massspectrometry，MS)lm)置于EP100mmol/L碳酸氫氨：乙腈(1：1)的溶液，37℃振搖30min。重復(fù)此步驟直到完全脫色，之后傾出液體，加50ul乙腈并使膠脫水l0-15min。假設(shè)膠塊沒Speed~Vac中完全枯燥(低溫狀態(tài)，15min)。在50mmoFL包含測序級胰酶的碳酸氫氨溶液中再水化。酶的儲存液是在25ug的胰酶中加250u10.1(15ul)被儲存在4℃下?；钚悦溉芤旱闹苽涫敲糠?5ul加100ul的50mmol/L碳酸氫氨溶液，終濃度是13ng/ul。參加約20ul的胰酶溶液于膠塊中(充分再水化后的膠塊)并放置在4℃下再水化45-60min，移走過量的胰酶溶液加入少量的50mmol/L(10-20ul)使膠塊在酶解過程中保持浸潤，37℃孵育1h，然后室溫下過夜。穎配制10mg／鋤的甜氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA1ul基質(zhì)和樣品混合液于靶上，讓靶自然枯燥，最終將靶裝入質(zhì)譜儀。(337nm,3nspulsewidth,3Hzrepetitionrate)，離子延遲提取100ns，Gridvoltage68％，真空度為4e-008，質(zhì)譜信號的單次掃描累加150次，842.512211.1046作為內(nèi)部標準校正。RT.PCR收集Hel~2細胞，離心沉淀細胞，每5-10x106個細胞參加1mlTrizol將上述細胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入到EP管中，在室溫下放置5在上述EP管中，依據(jù)lmlTrizol0．2ml氯仿的量參加氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力振蕩15秒，在室溫下放置2-3分鐘后，120230g(415取上層水相置于的EP管中，依據(jù)lmlTrizol0．5ml異丙醇的量參加異丙醇，在室溫下放置10分鐘，120230g(412)離心10分鐘。lmlTrizol加lml75％~7500g(4℃)離心5讓沉淀的RNARnase-freewaterRNA引輔的配爿與擴征將所合成的目的基因和GAPDH上下游引物(1OD)用0.1％DEPC水溶解。依據(jù)各個引物分子量的不同，計算加0.1％DEPC水的量。(3)目的基因和GAPDH上下游引物所加的0.1％DEPC水量分別為:488ul，431ul20pmol/ul。RT—PCR(25u1)：無酶:14.4ul；AMVBuff5ul：dNTP：0.5ul：目的基因上游引物：0.75ul：目的基因下游引物：0.75ul：GAPDH0.75uGAPDH0.75uMgS04TflDNAPoly0.5ul；RNA0.8ul；將上述各成分混勻并掩蓋石蠟油20p1，標注號碼后放入基因擴增儀內(nèi)。58℃60s，68℃2min共4068℃延長7min。擴增產(chǎn)物進展電泳或一20℃凍存。RT-PCR取6蛆RT-PCR產(chǎn)物與l眥上樣緩沖液混合后上樣于孫瓊脂糖0.8ulLadd0.5XTBE75my2／3后，紫外燈下觀察，掃描、拍照并進展圖像分析。圖像分析處理系統(tǒng)進展輝度掃描Q心DH校正作相對量分析，數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示。Westenblot2.3.1311DSDS-(SDS聚丙膏觸凝膠電泳)(1)SDS凝膠制好后，開頭加樣。加樣挨次依次為：蛋白質(zhì)分子量標準品，正常比照免疫沉淀樣品，卵巢癌患者免疫沉淀樣品：加樣量均為20mIxSDS凝膠加樣緩沖液。5m，在做銀染時取lul，剩余的體積由1×SDS開頭電泳，80V電泳15min，提高電壓到120V，連續(xù)電泳直至溴酚藍到達分別膠底部(約需要2h)。蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體剪取與凝膠一樣大小的硝酸纖維素膜和6層濾紙，將膜與濾PVDF膜，則要將PⅥ)F膜在甲醇中按轉(zhuǎn)膜電極板陰極至陽極方向，按類似“三明治”的放法，分別整齊疊放三層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜和三層濾紙，并用軟鉛筆在膜的一角作好標記，認真去除殘留在各層間的氣泡。冰浴中，100V，60min。兩曩纖維曩瞑的封閉、抗體的孵育及顯色轉(zhuǎn)膜完畢后，逐一掀去各層，把凝膠轉(zhuǎn)移至盛有考馬斯亮藍角以免鉛筆標記被抹去。用PBS10~15mi5(w/v)脫脂奶粉的PBST封閉液中，室溫振搖1h。PBsT漂洗膜3次，每次5~10min。將膜按對應(yīng)的10個泳道切成10個條帶，每個條帶依次放入清，其余9道分別參加不同的9個卵巢癌患者血清。每道血清按1：500稀釋即4山血清與2mll％(w，v)脫脂奶粉的PBST，室溫水平振蕩，至少孵育2h4℃過夜。PBST漂洗膜3次，每次5~10min。用含1％〔w/v〕脫脂奶粉的PBST稀釋的二抗(1:30000鼠抗IgG，APlh。(2ulPBST漂洗膜35～10min。往槽子中參加BCIP/NBT制，30min10～20min，認真觀看顯色。當?shù)鞍讞l帶的顏色到達要求后，用PBS洗膜3～5min，再用濾紙吸干膜上液體，照相保存試驗結(jié)果。挑出免疫印跡條帶差異較大的硝酸纖維素膜條帶應(yīng)的血清做免疫沉淀。結(jié)果和厚樸酚對HepG2細胞增殖的影響和厚樸酚體外外抑制HepG2作用時間呈正比。如Fig.3所示，我們用5、10、15、20ug/ml的和厚樸酚作用HepG25、8、12、24、72小時，觀看和厚樸酚對HepG2llepG2具有很強的抑制作用，從Fig.2.310ug/m1的和厚樸酚在24小時作用下，HepG2Fig-2.4104接種于9637℃C02510、15、20ug/mlHepG25、8、12、72和厚樸酚對HepG2細胞周期的影響HepG25、10、15ug/ml濃度和厚樸酚作用24小時，流S期有下降Fig.增加。這些結(jié)果進一步說明和厚樸酚引起HepG22.1HepG2不同濃度和厚樸酚作用細胞24小時后，收集細胞，用70%無水本，求其平均值。Fig.2.5HepG2不同濃度和厚樸酚作用細胞24小時后，收集細胞，用70%無水乙DMSO；(A)比照組；(B)2.5(C)5u咖l(D)10ug/ml用穩(wěn)定同位素標記HepG2細胞d3SiremaDMEM的亮氨酸，用同位素標記的培育基傳代細胞。收集傳代的細胞50kD左右的條帶(β-actine)提取Fig.5第七代時，通過質(zhì)譜Mode-TOF檢測，細胞標記到94.3％：細胞傳代到第十代時，細胞完全被同位素標記。HepG2細胞 M 同位素標記的細胞Fig.2.6收集正常H印G2細胞與同位素標記細胞RIPA白，上10％SDS聚丙烯酰胺凝膠，先用80V電泳15rain壓到120V，G250染色至過夜，然后脫色，經(jīng)成像掃描儀掃描成像Fig.2.7A:同位素標記HepG2細胸第七代提取蛋白的β-actine質(zhì)譜鑒定；b:同位素標記HepG2β-actine2．4．4分別收集一滿方瓶HepG2細胞和一瓶經(jīng)l0ug/ml濃度和厚樸酚作用24小時的同位素標記的HepG2RIPA裂解方法提取蛋白。承受DCY=0.104+0.052xHepG2細胞提取蛋白濃度：A=3.46mg／ml：10ug／ml濃度和厚樸酚作用24小時的同位素標記的HepG2細胞提取蛋白濃度：B=4.35mg／mlA與B按l:l濃度混合上一維電泳，切取Il-actineESI-MS-MS檢測。從Fig.7中可以看出：A與B1.lFig.2.8β-actine條帶質(zhì)譜圖正常HepG2細胞和經(jīng)10ug/ml濃度和厚樸酚作用24小時的同位素標記的HepG2細胞提取取蛋白按1:1Mascot“://www/matrixscience“://www/matrixscience網(wǎng)站上進展結(jié)果查詢的β-actine條帶?？偟鞍阻b定將正常H印G210ug／ml用24小時的同位素標記的HepG2細胞提取的蛋白按1:l維凝膠電泳(如Fig.2.9)將膠條切割成假設(shè)干小條帶，胰酶提取肽段。將提取的肽段用乙腈和O．1％的三氟乙酸溶解，用ESI-MS-MS驗證蛋白。Fig.2.9HepG21:1正常HepG2細胞和經(jīng)10ug/ug/ml濃度和厚樸酚作用24小時的同位素標記的HepG2細胞分別提取蛋白后,上10%SDS用120V電泳15min后，提高電壓到250V，結(jié)業(yè)續(xù)電泳直至溴酚藍到達分別膠底部，用G250染色至過夜，然后脫色，經(jīng)成像掃描儀掃描成像獲得的混合物肽片段質(zhì)量數(shù)據(jù)通過Mascot搜尋引擎進展檢索，在“://matrixscience/“://matrixscienceFig.2.1白質(zhì)。Fig.2.10應(yīng)用Mascota，Mascot搜尋主頁。登陸“://matrixscience/“matrixscience網(wǎng)站，進入MascotSearchPeptideMassFingerprint，點擊進入。b，PMF搜尋主頁。進入PeptideMassFingerprint檢索網(wǎng)頁后，選擇NCBInrcarbamidomethylOxidatioM〕和Pyro-glN-term；最大允許肽質(zhì)量誤差為0.1Da，每個肽允許有1個不完全裂解位點。C，檢索結(jié)果。得d具體相符肽段及氨基酸序列。被和厚樸酚調(diào)控蛋白的鑒定β-actine-d3峰強度比較，計算出定量蛋白的誤差范圍為+-4。對于其他蛋白，同樣依據(jù)質(zhì)譜鑒定的肽段，將-d3峰強度比較，平均每個質(zhì)譜鑒定出的肽段HepG2細胞蛋白中共鑒別了290Fig.2.11白的調(diào)控度。2．4．7將全部質(zhì)譜鑒定的蛋白從swisspot數(shù)據(jù)庫中，打出相應(yīng)的蛋白功能HepG2細胞所引起凋亡相關(guān)的蛋白〔如下表。2.1蛋白名稱

定量調(diào)控 功能蛋白肽Gi1801893Mass:146306 Sc0re:58 2 下調(diào)MarkerforlivercelllineagesQueriesmatched:7Leucine-richPPR-motifcontainingprotein

47.0%

repredented bythe cellline.Gi17706485Mass：80246Score:541下調(diào)MitochondrionQueriesmatched:2TNFreceptor-associatedprotein129.1%playandimportantroleintheinductionofapoptosis[H0mosapiens]Gi14759080Mass:73670 Score:931下調(diào)MitochondrialQueriesmatched:360.8%InvolvedintheoxidationofSuccinatedehydrogenasecomples,subunitA,flavoproteinsuccinateprecursor[Homosapiens]gi1226021Mass:67394 Scre:663下調(diào)ImportantintheregulationQueriesmatched:343.0%ofcellgrowthanddivisionGrowthregulatednuclear68proteinGil307066Mass:55885 Score:67 1 上調(diào)InvolvedintheregulationofQueriesmatched:213.3%cellgrowthInosine-5-monophosphatedehydrogenase(EC1.1.1205)Gi131645 Mass:36202 Score:7889上調(diào)Cythoplasm important roleQueriesmatched:69Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase〔12〕23.0%in regulanting the switchbetweendifferentpathwaysforenergyproductionGi15031857Mass:36950 Score:2615下調(diào)Cytoplasm,Queriesmatched:1528.7%Playsakeyrole intumorIactatedehydrogenaseA[Homosapiens]maintenanceGi156967119Mass:36631 Sc0re:3996上調(diào)MitochondrionQueriesmatched:17(8)20.8%Regulating mitochondrialChainB,SteructureOfHumanAnnexinA2respiration activity and inInThePresenceOfCalciumIonsagingGi11245769Mass:51917 Score:59Queriesmatched:4Fattyacidsynthase:FAS[H0mosapiens]Gi162088088 Mass:86325 Score:103Queriesmatched:7TransferringreceptorvariantGi1119360Mass:92696 Score:109

1 下調(diào)Cell membrane interface34.4% incoming signals to thereorganizationof the actincytoskeletonatthepaaxmamembrane promote neuriteoutgrowth5 下調(diào)Cellmembrane41.7%4 下調(diào)EndoplasmicreticulumQueriesmatched:11Endoplasminprecursor(Heatskockprotein90 kDabetamember1)(94kDagluose-regulatedprotein)(GRP94)(gp96homolog)(Tumorrejectionantigen1)

24.2%

MolecularchaperonethatFunctionsintheprocessingAnd transport of proteinsGi11082886Mass:75694Score:80 1 下調(diào)Transmits its message toQueriesmatced:8Tumor necrosis factor type 1 associatedproteinTRAP-1-human

31.4%

signaltransductionpathaysGi121264428 Mass:73920 Score:318 5 下調(diào)MitochondrionQueriesmatched:11Stress-70protein,mitochondrialprecursor(75Kdaglucosr-regulatedprotein)(GRP75)(Pertide-bindingprotein74)(PBP74)(Mortalin)(MOT)

23.6%

ImplicatedinthecontrolofcellproliferationandcellularagingMayalsoactasachaperoneGi15031875Mass:65153 Score:104Queriesmatched:7LaminA/Cisoform2[Homosapiens]

3 下調(diào)Innernuclearmembrane17.3%Gi124660110Mass:60976Score:723下調(diào)mitochondrialQueriesmatched:8(5)29.1%ATPsynthase,H+transporting,mitochondrialF1complex,alphasubunit,precursorGi1181400Mass:53656 Score:2055下調(diào)HelpstolinkthecontractileQueriesmatched:10Cytokeratin853.3%apparatus to dystrophin atthe costameres of striatedmuscleGi132189394Mass:56525 Score:95714下調(diào)Queriesmatched:45(16)42.6%ATPsynthase,H+transportingm,mitochondrialF1complex,brtasubunitprecursor[Homosapiens]Gi155959290Mass:22741Score:1033下調(diào)RegulatesphospholipaseA2Queriesmatched:325.9%activityAnnexinA1[Homosapiens]Gi118645167Mass:38780 Score:114

下調(diào)Basement

membraneQueriesmatched:5AnnexinA2[Homosapiens]

51.4%

Calcium-regulatedmembrane-bindingproteinQi11718024Mass:25002 Score:114

下調(diào)Cytoplasm/

CytoplasmicQueriesmatched:6

33.4%

vesicle

regulation ofPeroxiredoxin-6(EC5)(AntioxidantProtein2)(1-Cysperoxiredoxin)(1-Cysprx)(Acidiccalcium-independentphospholiaseA2)(EC3.1.1-)(aGo;32455266Mass:21918 Score:76

phospholipidturnover20 下調(diào)CytoplasmQueriesmatched:7Peroxieredoxin-2(EC5)(Thioredoxin

42.4%

Participateinthesignalingcascadesof growthfactorsperoxidase 1)

(Thioredoxin-dependent

and tumor necrosisperoxide

reductase

1)(Thio1-specific

factor-alaphaantioxidantprotein)(TSA)(PRPPCR在上述所選取的與細胞凋記相關(guān)的蛋白中，我們選擇RasGTPase-activating-likeproteinIQGAP1(p195)與94kDaglucose-regulatedprotein(GRP94)進展PCR進展驗證。首先我們設(shè)計他們的引物，RasGTPase-activating-likeproteinIQGAP1〔p195〕的引物為：IQGAP1-F：CCCAGAACAAGTCAAACCAAGIQGAP1-R：GTTTGCTTGCCTCTCCTGTC94kDaglucose-regulatedprotein(GRP94)z上物為：HSP90B-1-