發(fā)酵工業(yè)無菌技術(shù)

發(fā)酵工業(yè)無菌技術(shù)第1頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本章內(nèi)容一、概念

二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略三、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)四、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌

五、空氣除菌第2頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、概念：滅菌、消毒、除菌、防腐滅菌（sterilization）：用化學(xué)或物理方法殺死物料或設(shè)備中所有有生命物質(zhì)的過程。

消毒（disinfection）：用物理或化學(xué)方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物。

除菌（degermation）:用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。

防腐（antisepsis）:用物理或化學(xué)方法殺死或抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖

。消毒與滅菌的區(qū)別消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用第3頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略（一）污染的危害（二）污染的防治

第4頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.染菌的不良后果

消耗營(yíng)養(yǎng)合成新產(chǎn)物；菌體自溶、發(fā)粘等造成分離困難改變pH分解產(chǎn)物噬菌體破壞極大第5頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.染菌危害的具體分析

（1）染菌對(duì)不同菌種發(fā)酵的影響A．細(xì)菌谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，營(yíng)養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制菌生長(zhǎng)和合成代謝產(chǎn)物。第6頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月B.霉菌PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，發(fā)酵一無所獲。檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。C.酵母菌:易污染細(xì)菌以及野生酵母菌

D.疫苗：無論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。（1）染菌對(duì)不同菌種發(fā)酵的影響第7頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）染菌種類對(duì)發(fā)酵的影響青霉素：怕染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌鏈霉素：怕染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌檸檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染第8頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響種子擴(kuò)大時(shí)期染菌：滅菌后棄去發(fā)酵前期染菌：應(yīng)迅速重新滅菌，補(bǔ)充必要的營(yíng)養(yǎng)成分，重新接種發(fā)酵中期染菌：挽救困難，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，快處理，處理方法應(yīng)根據(jù)各種發(fā)酵的特點(diǎn)和具體情況來決定抗生素發(fā)酵

檸檬酸發(fā)酵

a.污染細(xì)菌：加大通風(fēng)，加速產(chǎn)酸，調(diào)pH3.0，抑制細(xì)菌。

b.污染酵母：加入0.025~0.035g/LCuSO4抑制酵母；通風(fēng)加大，加速產(chǎn)酸。

第9頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響檸檬酸發(fā)酵c.染黃曲霉：加入另一罐將近發(fā)酵成熟的醪液，pH下降，黃曲霉自溶。

d.青霉菌：在pH很低下能夠生長(zhǎng)。提前放罐。發(fā)酵后期污染染菌量不太多，可繼續(xù)發(fā)酵污染嚴(yán)重，則提前放罐殺菌劑的添加：前期無必要，增加成本；發(fā)現(xiàn)后加入，效果要具體評(píng)價(jià)第10頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）雜菌污染對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：pH不斷下降，菌絲大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過濾困難。處理方法：①將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；②先加絮凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀。雜菌分泌較多蛋白質(zhì)雜質(zhì)時(shí)，對(duì)發(fā)酵后處理過程中采用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間極易發(fā)生乳化。第11頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.染菌的檢查與判斷顯微鏡檢查法鏡檢出雜菌需要一定時(shí)間平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法：菌落噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑肉湯培養(yǎng)檢查法發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象判斷DO2水平異常變化pH異常變化尾氣CO2異常變化

第12頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月12第13頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月污染原因分析

主要原因：

①

種子帶菌②無菌空氣帶菌③設(shè)備滲漏④滅菌不徹底

⑤操作失誤⑥技術(shù)管理不善

第14頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月預(yù)防種子帶菌的防治

滅菌徹底接種可靠：無菌室及設(shè)備可靠，無菌操作可靠保藏可靠過濾空氣帶菌的防治設(shè)備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治

第15頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月“死角”

發(fā)酵罐的“死角”法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支撐件口：人孔（或手孔）、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進(jìn)料管口發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”

消除方法：加強(qiáng)清洗并定期鏟除污垢；安裝放汽邊閥管道安裝不當(dāng)或配置不合理形成的“死角”第16頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”第17頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月法蘭連接不當(dāng)造成的“死角”第18頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月滅菌時(shí)蒸汽不易通達(dá)的“死角”及其消除方法第19頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基與設(shè)備滅菌不徹底的防治原料性狀：大顆粒的原料過篩除去。實(shí)罐滅菌時(shí)要充分排除罐內(nèi)冷空氣。滅菌過程中產(chǎn)生的泡沫造成染菌：添加消泡劑防止泡沫升頂連消不徹底：最好采用自動(dòng)控制裝置滅菌后期罐壓驟變

死角操作不當(dāng)造成染菌

噬菌體染菌及其防治

預(yù)防第20頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月采取哪些措施能夠保持無菌發(fā)酵？物料、培養(yǎng)基、中間補(bǔ)料要滅菌；發(fā)酵設(shè)備及輔助設(shè)備（空氣過濾裝置、各種發(fā)酵罐進(jìn)出口連接裝置）和管道要滅菌；好氣發(fā)酵通入的空氣要除菌；種子無污染；接種無菌操作過關(guān)；為了保持發(fā)酵的長(zhǎng)期無菌狀態(tài)，需維持正壓。第21頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月有關(guān)細(xì)菌耐熱性的特性（1）熱力致死速率曲線或活菌殘存數(shù)曲線微生物及其芽孢的熱處理死亡數(shù)是按指數(shù)遞減或按對(duì)數(shù)循環(huán)下降的。若以縱坐標(biāo)為物料單位值內(nèi)細(xì)胞數(shù)或芽孢數(shù)的對(duì)數(shù)值，以橫坐標(biāo)為熱處理時(shí)間，可得到一直線——熱力致死速率曲線或活菌殘存數(shù)曲線。圖1熱力致死速率曲線DDDDDD第22頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）D值圖1表明，直線橫過一個(gè)對(duì)數(shù)循環(huán)時(shí)所需要的時(shí)間（分鐘）就是D值（Decimalreductiontime）。也就是直線斜率的倒數(shù)。直線斜率實(shí)際反映了細(xì)菌的死亡速率。D值的定義就是在一定的處理環(huán)境中和在一定的熱力致死溫度條件下某細(xì)菌數(shù)群中每殺死90%原有殘存活菌數(shù)時(shí)所需要的時(shí)間。第23頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月D值越大，細(xì)菌的死亡速率越慢，即該菌的耐熱性越強(qiáng)。因此D值大小和細(xì)菌耐熱性的強(qiáng)度成正比。注意：D值不受原始菌數(shù)影響D值隨熱處理溫度、菌種、細(xì)菌活芽孢所處的環(huán)境和其它因素而異。第24頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第25頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月表1瞬間加熱和冷卻條件下單位時(shí)間為D時(shí)的細(xì)菌死亡速率單位時(shí)間為D時(shí)的加熱時(shí)間（分鐘）單位容積殘存活菌數(shù)0D1041D1032D1023D1014D1005D10-16D10-27D10-38D10-4第26頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月從表1可以看出，從5D以后，為負(fù)指數(shù)，也就是說有1/10~1/10000活菌殘存下來的可能。細(xì)菌和芽孢按分?jǐn)?shù)出現(xiàn)并不顯示，這只是表明理論上很難將活菌完全消滅掉。實(shí)際上，這應(yīng)該從概率的角度來考慮，如果100支試管中各有1ml懸浮液，每ml懸浮液中僅含有1個(gè)芽孢，經(jīng)過5D處理后，殘存菌數(shù)為10-1，即1/10活10/100，也就是100支試管中可能有90支不再有活菌存在，而10支尚有活菌的可能。第27頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月D值可以根據(jù)圖1中直線橫過一個(gè)對(duì)數(shù)循環(huán)所需的熱處理時(shí)間求得。當(dāng)然也可以根據(jù)直線方程式求得，因?yàn)樗鼮橹本€斜率的倒數(shù)，即：

第28頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例1：

100℃熱處理時(shí)，原始菌數(shù)為1×104，熱處理3分鐘后殘存的活菌數(shù)是1×101，求該菌D值。即D100℃=1.00第29頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Z（3）熱力致死時(shí)間曲線（TDT曲線）ThermalDeathTime：熱力溫度保持恒定不變，將處于一定條件下的懸浮液中某一菌種的細(xì)胞或芽孢全部殺死所必需的最短熱處理時(shí)間。圖2熱力致死時(shí)間曲線第30頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌的熱力致死時(shí)間隨致死溫度而異。它表示了不同熱力致死溫度時(shí)細(xì)菌芽孢的相對(duì)耐熱性。與熱力致死速率曲線一樣，若以熱處理溫度為橫坐標(biāo)，以熱處理時(shí)間為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)值），就得到一條直線，即熱力。表明熱力致死規(guī)律同樣按指數(shù)遞降進(jìn)行。第31頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Z值的概念：直線橫過一個(gè)對(duì)數(shù)循環(huán)所需要改變的溫度數(shù)（℃）。換句話說：Z值為熱力致死時(shí)間按照1/10，或10倍變化時(shí)相應(yīng)的加熱溫度變化（℃）。Z值越大，因溫度上升而取得的殺菌效果就越小。第32頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月通常用121℃（國(guó)外用250F°或121.1℃）作為標(biāo)準(zhǔn)溫度，該溫度下的熱力致死時(shí)間用符號(hào)F來表示，并稱為F值。F值的定義就是在121.1℃溫度條件下殺死一定濃度的細(xì)菌所需要的時(shí)間——F值與原始菌數(shù)是相關(guān)的。

若T2=121.1℃，則t2=F

第33頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月除菌的方法培養(yǎng)基的加熱滅菌（包括常壓或蒸汽高壓加熱法）空氣的過濾除菌紫外線或電離輻射化學(xué)藥物滅菌第34頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第35頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）高溫殺菌作用的種類

高溫致死原理：由于它使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物高分子發(fā)生變性、破壞，例如它可使核酸發(fā)生脫氨、脫嘌呤或降解，以及破壞細(xì)胞膜上的類脂質(zhì)成分等。濕熱滅菌要比干熱滅菌更有效，這一方面是由于濕熱易于傳遞熱量，另一方面是由于濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，從而加速其變性。第36頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第37頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1．干熱滅菌法，將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱烘箱內(nèi)，在150～170℃下維持1～2h后，即可達(dá)到徹底滅菌的目的。在這種條件下，可使細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性、原生質(zhì)干燥，以及各種細(xì)胞成分發(fā)生氧化。灼燒，是一種最徹底的干熱滅菌方法，但它只能用于接種環(huán)、接種針等少數(shù)對(duì)象的滅菌。第38頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2．濕熱滅菌法濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。多數(shù)細(xì)菌和真菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在60℃左右處理5～10min后即可殺死；酵母菌和真菌的孢子稍耐熱些，要用80℃以上的溫度處理才能殺死；而細(xì)菌的芽孢最耐熱，一般要在120℃下處理15min才能殺死。第39頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）常壓法巴氏消毒法（pasteurization）

用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進(jìn)行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，其主要目的是殺死其中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風(fēng)味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法低溫維持法：在63℃下保持30分鐘可進(jìn)行牛奶消毒；高溫瞬時(shí)法：用于牛奶消毒時(shí)只要在72℃下保持15秒鐘即可。第40頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月間歇滅菌法，又稱丁達(dá)爾滅菌法或分段滅菌法。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。方法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在80～100℃下蒸煮15～60分鐘，以殺死其中所有微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或37℃下保溫過夜，誘導(dǎo)殘留的芽孢發(fā)芽，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復(fù)3天，即可在較低溫度下達(dá)到徹底滅菌的效果。第41頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）加壓法常規(guī)加壓滅菌法盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋加熱煮沸，徹底驅(qū)盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱至121℃（壓力為1kg／cm2或15磅／英寸2），時(shí)間維持15～20分鐘，也可采用在較低的溫度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下維持35分鐘的方法。此法適合于一切微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對(duì)培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌。第42頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

連續(xù)加壓滅菌法在發(fā)酵行業(yè)里也稱“連消法”。此法只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。主要操作：將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進(jìn)行加熱、維持和冷卻，然后才進(jìn)入發(fā)酵罐。培養(yǎng)基一般在135～140℃下處理5～15秒鐘。第43頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月連續(xù)加壓滅菌法優(yōu)點(diǎn)

①因采用高溫瞬時(shí)滅菌，故既可殺滅微生物，又可最大限度減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，從而提高了原料的利用率，比“實(shí)罐滅菌”（120℃，30分鐘）提高產(chǎn)量5～10%；②由于總的滅菌時(shí)間較分批滅菌注明顯減少，所以縮短了發(fā)酵罐的占用周期，從而提高了它的利用率；③由于蒸汽負(fù)荷均勻，故提高了鍋爐的利用率；④適宜于自動(dòng)化操作；⑤降低了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。第44頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）影響加壓蒸汽滅菌效果的因素

（1）滅菌物體含菌量的影響。天然原料尤其是麩皮等植物性原料配成的培養(yǎng)基，一般含菌量較高，而用純粹化學(xué)試劑配制成的組合培養(yǎng)基，含菌量低。第45頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響

檢驗(yàn)滅菌鍋內(nèi)空氣排除度，可采用多種方法。最好的辦法是滅菌鍋上同時(shí)裝有壓力表和溫度計(jì)，其次是將待測(cè)氣體通過橡膠管引入深層冷水中，如只聽到“撲撲”聲而未見有氣泡冒出，也可證明鍋內(nèi)已是純蒸汽了。

第46頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）滅菌對(duì)象pH的影響（4）滅菌對(duì)象的體積。要防止用常規(guī)的壓力和時(shí)間在加壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行大容量培養(yǎng)基的滅菌。（5）加熱與散熱速度。這兩段時(shí)間也對(duì)滅菌效果和培養(yǎng)基成分發(fā)生影響。為了使科學(xué)研究的結(jié)果有良好的重演性，在滅菌操作中對(duì)這些技術(shù)細(xì)節(jié)都應(yīng)加以注意。第47頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）高溫對(duì)培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止

第48頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月消除高溫有害影響的措施（1）采用特殊加熱滅菌法

（2）對(duì)易破壞的含糖培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí)，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；（3）對(duì)含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；第49頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）對(duì)含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進(jìn)行低壓滅菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下滅菌15分鐘）或間歇滅菌；（5）在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌第50頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）滅菌設(shè)備

l、高壓蒸汽滅菌

生產(chǎn)中使用高壓蒸汽滅菌鍋的型號(hào)很多

手提式滅菌鍋，容量小，多用于母種培養(yǎng)基滅菌。

立式或臥式滅菌鍋較大，多用于原種或少量栽培種培養(yǎng)基的滅菌，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。

滅菌柜要和蒸汽鍋爐配套，用于大量的原種和栽培種培養(yǎng)基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶(袋)。但投資太大，適合大型菌種場(chǎng)使用。

第51頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2．常壓蒸汽滅菌鍋

常壓蒸汽滅菌鍋是用鐵鍋、磚、水泥砌成的，造價(jià)低，適于一般生產(chǎn)單位和專業(yè)戶使用。大小可根據(jù)需要而定，但最大的鍋每次裝料也最好不超過500公斤。

3．烘箱

烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和滅菌，也可用于其它物品烘干。第52頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、滅菌的實(shí)際操作

（一）空罐滅菌空罐滅菌也稱空消。無論是種子罐、發(fā)酵罐、還是尿素（或液氨）罐、消泡罐，當(dāng)培養(yǎng)基（或物料）尚未進(jìn)罐前對(duì)罐進(jìn)行預(yù)先滅菌，為空罐滅菌。為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢，空罐滅菌要求溫度較高，滅菌時(shí)間較長(zhǎng)，只有這樣才能殺死設(shè)備中各死角殘存的雜菌或芽孢。第53頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）實(shí)罐滅菌將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后，維持一定時(shí)間，再冷卻到發(fā)酵溫度，然后接種發(fā)酵，這叫做實(shí)罐滅菌，又稱分批滅菌。操作要點(diǎn)：三路進(jìn)汽：直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時(shí)間。這就是所謂的“三路進(jìn)氣”。

第54頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基連消工藝流程圖

第55頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程第56頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第57頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）過濾除菌法

是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí)，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。第58頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。濾膜過濾裝置、燒結(jié)玻璃濾板過濾器、石棉板過濾器（Seitz濾器）、素?zé)蛇^濾器以及硅藻土過濾器等。過濾除菌的缺點(diǎn)是無法去除其中的病毒和噬菌體。第59頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）其他方法

在配制培養(yǎng)基時(shí)，為避免發(fā)生沉淀，一般應(yīng)按配方逐一加入各種成分。另外，加入0.01％EDTA或0.01％NTA（氮川三乙酸）等螯合劑到培養(yǎng)基中，可防止金屬離子發(fā)生沉淀。最后，還可以用氣體滅菌劑如氧化乙烯等對(duì)個(gè)別成分進(jìn)行滅菌處理。第60頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、化學(xué)殺菌劑或制菌劑

第61頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）表面消毒劑常用消毒劑的種類很多，它們的殺菌強(qiáng)度各不相同。但幾乎都有一個(gè)共同規(guī)律，即當(dāng)其在極低濃度時(shí)，常常會(huì)對(duì)微生物的生命活動(dòng)起刺激作用，隨著濃度逐漸增高，就相繼出現(xiàn)制菌和殺菌作用，因而形成一個(gè)連續(xù)的作用譜。表面消毒劑是指對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性，不能用作活細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)治療用的化學(xué)藥劑。

第62頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月為比較各種表面消毒劑的相對(duì)殺菌強(qiáng)度，常采用在臨床上最早使用的消毒劑——石炭酸作為比較的標(biāo)準(zhǔn)，并提出了石炭酸系數(shù)這一指標(biāo)。所謂石炭酸系數(shù)，指在一定時(shí)間內(nèi)被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達(dá)到同效的石炭酸的最高稀釋度的比率。一般規(guī)定處理時(shí)間為10分鐘，而供試菌定為Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）。第63頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第64頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月消毒試驗(yàn)

⑴以人工染菌實(shí)物為消毒對(duì)象，模擬現(xiàn)場(chǎng)表面污染大腸桿菌液。⑵消毒前采樣：放置無菌規(guī)格板，取無菌棉拭于含5ml稀釋液試管中沾濕，在規(guī)格板空心處旋轉(zhuǎn)自左至右涂抹整個(gè)區(qū)域。⑶消毒后采樣：在前采樣地點(diǎn)旁用0.05％過氧乙酸溶液消毒物體表面，30分鐘后將無菌棉拭于含5ml采樣液試管中沾濕，作為消毒后樣液。⑷將消毒前后樣液充分振蕩搖勻后稀釋。⑸培養(yǎng)待凝固后37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，作菌落計(jì)數(shù)。第65頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月滅菌效果監(jiān)測(cè)１、高壓蒸氣滅菌效果監(jiān)測(cè)(1)高壓蒸氣滅菌指示卡：將卡片放入滅菌器不同部位，觀察滅菌后指示卡顏色變化。(2)芽胞菌片法：將每片染有嗜熱脂肪桿菌芽胞105cfu/ml的菌片包好、放入滅菌器內(nèi)。滅菌后作細(xì)菌計(jì)數(shù)測(cè)定。對(duì)照是不經(jīng)滅菌的菌片，芽胞完全被殺滅或殺來率達(dá)99.9999％為合格。第66頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月２、紫外線消毒效果監(jiān)測(cè)（1）微型紫外線強(qiáng)度計(jì)：使用時(shí)打開儀器開關(guān)，裝入電池，打開電源開關(guān)，接通電源，將測(cè)定電壓轉(zhuǎn)換開關(guān)撥至電壓一方，此時(shí)指針應(yīng)超過中線。測(cè)定時(shí)，將測(cè)定電壓轉(zhuǎn)換開關(guān)撥至測(cè)定一方，打開紫外線燈照射２分鐘后，將紫外線燈強(qiáng)度計(jì)置于紫外線燈下垂直１Ｍ的中央進(jìn)行照射，直至儀表指針穩(wěn)定，所示之值即為該紫外線燈的強(qiáng)度值(uw/cm2)。第67頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）紫外線強(qiáng)度與消毒劑量指示卡：測(cè)定燈管強(qiáng)度時(shí)，將卡片置于離紫外燈管１Ｍ的中央處，將圖案一面朝向燈管，照射一分鐘（照射時(shí)間要準(zhǔn)確）后，圖案正中涂層由白色變?yōu)樽霞t色。與周圍相應(yīng)色塊相比，可測(cè)知所照射的強(qiáng)度。新燈管以不低于100uw/cm2為合格，舊燈管低于70uw/cm2應(yīng)更換。第68頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月空氣的凈化第69頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、空氣中微生物的分布空氣中微生物的含量和種類，隨地區(qū)，季節(jié)和空氣中灰塵粒子多少，以及人們的活動(dòng)情況而異。北方氣候干燥，寒冷，空氣中的含菌量較多，離地面越高，含菌量越少；一般每升高10米，空氣中的含菌量就降低一個(gè)數(shù)量級(jí)；城市的空氣中含菌量較多，農(nóng)村的空氣中含菌量較少，一般城市空氣中雜菌數(shù)為3000～8000個(gè)／米3

。第70頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月空氣中的微生物種類以細(xì)菌和細(xì)菌芽胞較多，也有酵母，霉菌和病毒。這些微生物大小不一，一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上，空氣中微生物的含量一般為103～104個(gè)/米3?；覊m粒子的平均大小約0.6μm左右，所以空氣除菌主要是去除空氣中的微粒（0.6-1μm）第71頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、空氣除菌

工業(yè)發(fā)酵對(duì)空氣處理的要求隨發(fā)酵產(chǎn)品和菌種不同而異。半固體制曲和酵母生產(chǎn)中無菌要求不十分嚴(yán)格，一般無需復(fù)雜的空氣凈化處理；密閉的深層通氣發(fā)酵需嚴(yán)格的純凈培養(yǎng)，進(jìn)入發(fā)酵罐前空氣必須進(jìn)行冷卻、脫水、脫油和過濾除菌等處理。第72頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）發(fā)酵對(duì)空氣無菌程度的要求好氣性發(fā)酵過程中需要大量的無菌空氣，空氣要做到絕對(duì)無菌在目前是不可能的，也是不經(jīng)濟(jì)的。發(fā)酵對(duì)無菌空氣的要求是：無菌，無灰塵，無雜質(zhì)，無水，無油，正壓等幾項(xiàng)指標(biāo)。發(fā)酵對(duì)無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發(fā)酵過程中不因無菌空氣染菌，而造成損失即可。在工程設(shè)計(jì)中一般要求1000次使用周期中只允許有一個(gè)菌通過，即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為N=10-3。第73頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月我國(guó)GMP把藥廠潔凈度分為四級(jí)：潔凈區(qū)：100級(jí)，10000級(jí)控制區(qū)：100000級(jí)，300000級(jí)。控制區(qū)：人員均須更衣后經(jīng)緩沖室才能進(jìn)入潔凈區(qū)：人員應(yīng)經(jīng)淋浴、更衣、風(fēng)淋后才能進(jìn)入第74頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、空氣除菌的方法

（一）輻射殺菌

（二）熱殺菌

（三）靜電除菌（四）過濾除菌第75頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1．輻射滅菌法

最常用的是用紫外光線進(jìn)行無菌室滅菌。2537?波長(zhǎng)的紫外線具有極強(qiáng)烈的殺菌效力，它的主要作用是使微生物的DNA分子產(chǎn)生的胸腺嘧啶的二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。無菌室常用的紫外燈功率為30W，安裝在操作臺(tái)上方一米左右高處，每次照射15-30min既可。紫外線有很強(qiáng)的殺菌力，但穿透力很弱，一張薄紙即可完全擋住紫外線，因此待滅菌物品必須置于紫外光直接照射下，而且在一定范圍內(nèi)作用強(qiáng)度與距離平方成反比。此外，紫外線對(duì)人體組織有一定刺激作用，眼睛、皮膚受照射后會(huì)產(chǎn)生某些癥狀，所以工作人員在無菌室操作時(shí)應(yīng)關(guān)閉紫外燈。第76頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、熱滅菌原理：基于加熱后微生物體內(nèi)的蛋白（酶）熱變性而得以實(shí)現(xiàn)。熱空氣進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般均需用壓縮機(jī)壓縮，提高壓力?？諝鈮嚎s后溫度能達(dá)到200℃以上，保持一定時(shí)間后，便可實(shí)行干熱殺菌。利用空氣壓縮時(shí)所產(chǎn)生的熱量進(jìn)行滅菌的原理對(duì)制備大量無菌空氣有特別意義。實(shí)際應(yīng)用中需考慮培養(yǎng)裝置與空氣壓縮機(jī)的相對(duì)位置，連接壓縮機(jī)與培養(yǎng)裝置的管道的滅菌以及管道長(zhǎng)度等。第77頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、靜電除菌靜電除塵器可除去空氣中的水霧、油霧、塵埃，同時(shí)也除去微生物。原理：利用靜電引力來吸附帶電粒子而達(dá)到除塵滅菌目的。對(duì)于一些直徑小的微粒，所帶電荷小，不能被吸附而沉降。第78頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、介質(zhì)過濾除菌

介質(zhì)過濾除菌是使空氣通過經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達(dá)到除菌的目的。從可靠性，經(jīng)濟(jì)適用與便于控制等方面考慮，目前仍以介質(zhì)過濾法較好，也是大多數(shù)發(fā)酵廠廣泛采用的方法。第79頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、對(duì)空氣除菌流程的要求要制備較高無菌程度，具有一定壓力的無菌空氣，它的流程設(shè)備有空氣壓縮機(jī)。附屬設(shè)備要求盡量采用新技術(shù)，提高效率，減少設(shè)備，精簡(jiǎn)設(shè)備投資、運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用和動(dòng)力消耗，簡(jiǎn)便操作。流程的制訂就根據(jù)所在的地理、氣候環(huán)境和設(shè)備條件而考慮。第80頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

在環(huán)境污染比較嚴(yán)重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件，以降低過濾器的負(fù)荷，提高空氣的無菌程度；在溫暖潮濕的南方，要加強(qiáng)除水設(shè)施，以確保和發(fā)揮過濾器的最大除菌效率；在壓縮機(jī)耗油嚴(yán)重的設(shè)備流程中則要加強(qiáng)消除油霧的污染等等。第81頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、空氣除菌流程分析要保持過濾器有比較高的過濾效率，應(yīng)維持一定的氣流速度和不受油、水的干擾。氣流速度可由操作來控制；要保持不受油、水干擾則要有一系列冷卻、分離、加熱的設(shè)備來保證空氣的相對(duì)濕度在50%～60%的條件下過濾。第82頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月高空取氣管

高空取氣管是遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。一般而言，地面附近空氣中所含的微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，據(jù)資料介紹，每升高10米，空氣中雜菌可降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。第83頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月油水分離器其內(nèi)部同時(shí)采用直接攔截，慣性碰撞，布朗擴(kuò)散及凝聚等機(jī)理，能有效地去除空氣中的水、油霧、塵埃，內(nèi)部不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長(zhǎng)。第84頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月１——粗過濾器２——壓縮機(jī)３——貯罐４、6——冷卻器

５——絲網(wǎng)分離器8——加熱器７、9——過濾器

空氣凈化的流程第85頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程圖

1-粗過濾器；2-壓縮機(jī)；3-貯罐；4-冷卻器；5-絲網(wǎng)分離器；6-過濾器第86頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

利用熱空氣加熱冷空氣的流程示意圖

1-高空采風(fēng)；2-粗過濾器；3-壓縮機(jī)；4-熱交換器；5-冷卻器；6，7-析水器；8-空氣總過濾器；9-空氣分過濾器第87頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月將空氣冷卻至露點(diǎn)以上的流程1－高空采風(fēng)；2－粗過濾器；3－壓縮機(jī)；4－冷卻器；5－冷卻器；6－空氣總過濾器；7－空氣分過濾器第88頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月高效前置過濾空氣除菌流程圖1—高效前置過濾器；2—壓縮機(jī)；3—貯罐；4—冷卻器；5—絲網(wǎng)分離器；6—加熱器；7—過濾器第89頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一次冷卻和析水的空氣過濾流程示意圖1－高空采風(fēng)；2－粗過濾器；3－壓縮機(jī)；4－冷卻器；5，6—析水器；7—貯罐；8—加熱器；9—空氣總過濾器；10—空氣分過濾器第90頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月空氣凈化的流程吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過壓縮前的過濾。進(jìn)入空氣壓縮機(jī)（120-150℃）。冷卻（20-25℃），除去油、水，再加熱至30-35℃。最后通過總過濾器和分過濾器除菌，獲得潔凈度、壓力、溫度和流量都符合要求的無菌空氣。第91頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、過濾除菌設(shè)備原理

概述：目前發(fā)酵工廠采用的空氣過濾設(shè)備大多數(shù)是傳統(tǒng)的深層過濾設(shè)備，濾層厚度一般為1～2米，所用的過濾介質(zhì)一般是棉花、活性炭，也有采用玻璃纖維、焦炭等。對(duì)不同的材料，材料的不同規(guī)格，材料的填充情況不同，都會(huì)得到不同的過濾效果。為了制取適合要求的無菌空氣，就得深入研究深層過濾的各種關(guān)系。第92頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）深層過濾原理深層過濾所用的過濾介質(zhì)—棉花的纖維直徑一般為16～20um。充填系數(shù)為8%時(shí)，棉花纖維所形成網(wǎng)格的孔隙為20～50um，微粒大小為（0.5-2um）。微粒隨氣流通過濾層時(shí)，濾層纖維所形成的網(wǎng)格阻礙氣流前進(jìn)，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)方向，繞過纖維前進(jìn)。這些改變引起微粒以對(duì)濾層纖維產(chǎn)生慣