現(xiàn)代生物技術的綜合實驗

現(xiàn)代生物技術的綜合實驗第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月本課程實驗項目（54學時）實驗1、質粒DNA的制備與質量鑒定（包含瓊脂糖凝膠電泳）實驗2、質粒DNA的片段化與分離實驗3、大分子DNA的制備和質量鑒定實驗4、PCR反應實驗5、PCR產品純化及克隆實驗6、感受態(tài)細胞制備及轉化實驗7、利用不同的方法篩選和鑒定轉化子（綜合設計實驗，18學時）第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗要求兩人一組，獨立實驗每次實驗完成均要求寫實驗報告及思考題不得曠課，特殊情況可補實驗每次實驗安排2人配制瓊脂糖凝膠本課程考核前6個實驗共計50分（實驗報告和思考題）

（本部分成績也是《基因工程》的平時成績）綜合實驗（包括設計報告）共計50分第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗一質粒DNA的制備與質量鑒定一、實驗目的

學習并掌握基因工程操作技術中最常用的載體質粒DNA的提取方法。第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理

在堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結構遭破壞而發(fā)生變性，但由于質粒DNA分子量相對較小，且呈環(huán)狀超螺旋結構，即使在高堿性pH條件下，兩條互補鏈也不會完全分離，當加入中和緩沖液時，變性質粒DNA又恢復到原來的構型；而線性的大分子量細菌染色體DNA則不能復性，與細胞碎片、蛋白質、SDS等形成不溶性復合物，通過離心沉淀，細胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質等可被除去，而質粒DNA及小分子量的RNA則留在上清液中，再用酚/氯仿處理，可去除殘留蛋白質，混雜的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實驗材料與主要試劑實驗材料：含pEGFP質粒的大腸桿菌DH5α

主要試劑：

溶液I：50mM葡萄糖，10mMEDTA，

25mMTris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4mg/L

溶液II：0.2mol/LNaOH溶液（內含1%SDS）,現(xiàn)配現(xiàn)用溶液III（pH4.8）:60mL5mol/L醋酸鉀，11.5mL冰醋酸，

28.5mLH2O；飽和酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V）

TE緩沖液（pH8.0）:10mMTris-HCl，1mMEDTA，含RNA酶（RNaseA）:20μg/ml

醋酸鈉（pH5.2）、70%乙醇、無水乙醇第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實驗步驟1)吸取1.4ml菌液至1.5ml離心管中。2)離心(8000r/min，1min)，棄上清液（根據(jù)菌液濃度判斷是否需要重復1~2次）。3)加入150μL溶液Ⅰ，用旋渦振蕩器充分懸浮菌體。4)加入200μL溶液Ⅱ，加蓋后溫和顛倒5~6次，直至呈透明狀。此步驟在5分鐘內完成。5)加入150μL預冷的溶液Ⅲ，加蓋后反復顛倒混勻，直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰浴5min。6)離心(14000r/min，5min)，移取上清液于另一干凈離心管。第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月7)向上清液中加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），振蕩混勻抽提，離心(14000r/min，5min)，溶液將出現(xiàn)分層。8)移取上層水相溶液（約450~500μL）于另一干凈離心管，加等體積氯仿，振蕩混勻抽提，離心(14000r/min，5min)，溶液將出現(xiàn)分層。9)移取上層水相溶液于另一干凈離心管，加入1/10體積的醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積無水乙醇混勻，冰浴30min。10)離心(14000r/min，10min，4℃)，倒掉上清液。第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月11)加0.5ml預冷的70%酒精振蕩，洗DNA沉淀一次，離心5min，倒掉上清液。12)真空抽干或室溫自然干燥.13)加20~30μLTE緩沖液使DNA完全溶解，室溫放置10min，降解RNA雜質，少量用于瓊脂糖凝膠質量檢測，剩余質粒-20℃保存?zhèn)溆谩?4)1%瓊脂糖凝膠配制：稱取1g瓊脂糖粉末，加入100ml0.5倍TBE溶液，加熱熔化，稍降溫后，加入5μL溴化乙錠（EB），混勻，制備凝膠板，冷卻后備用。第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月15)每位同學各取5μL質粒DNA加入1μL6×loadingbuffer，混勻，進行點樣。16)電泳條件：120v，40min；電泳完成后，膠塊通過凝膠成像系統(tǒng)檢測，觀察實驗結果，并拍照記錄。五、實驗結果

觀察并分析電泳圖片六、實驗報告按實驗內容完成實驗報告及教材上的思考題。第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗二質粒DNA的片斷化及分離

一、實驗目的

1、學習利用紫外分光光度法鑒定DNA質量

2、采用Ⅱ型限制性核酸內切酶切割質粒DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切效果。第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理

DNA吸收光譜峰在260nm處，測定此波長下DNA溶液的OD值，當OD260=1時，雙鏈DNA含量約為50μg/mL，據(jù)此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA含量。由于蛋白質吸收峰在280nm處，在測定DNA含量時，通過計算OD260/OD280值，可了解所測DNA的純度，如該值為1.8～2.0時，DNA純度高。已知Ⅱ型限制性核酸內切酶能專一識別堿基序列，并在該處切斷雙鏈DNA，形成一定長度和序列的DNA片段。酶切反應需Mg2+等金屬離子以及一定濃度的鹽離子，不同內切酶對鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當或甘油含量過高（﹥5%），會使酶的識別位點發(fā)生改變，產生星活性。絕大多數(shù)酶的反應溫度37℃。第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實驗材料：

實驗一提取的質粒DNA四、試劑

限制性核酸內切酶XbaI；緩沖液10×MBuffer；0.1%BSA;0.5×TBEBuffer；1%瓊脂糖五、實驗步驟

1、DNA的測定

空白測定(Blank)：吸取200μlTE緩沖液至比色杯，進行空白測定。

DNA測定(Sample)：取質粒DNA1μl至一干凈的離心管，加入199μlTE緩沖液稀釋混勻，所有溶液加入到干凈的比色杯中，測定260nm及280nm的光吸收值；計錄DNA濃度及OD260/OD280比值。第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2、酶切反應

酶切反應液的配制:

Xba

I1μl10×Mbuffer2μl0.1%BSA2μlDNA5μl(根據(jù)質粒濃度來確定用量)ddH2O10μl

酶切反應條件：37℃水浴2～3小時。3、電泳檢測

反應結束后，向反應液中加入2.5μl10×loadingbuffer，混勻，用以停止酶切反應，所有22.5μl樣品均點在同一個點樣孔中。電泳條件：120V,20分鐘左右。第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月六、實驗結果

觀察并分析電泳圖片。七、實驗報告按實驗內容完成實驗報告及教材上的思考題。第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗三大分子DNA的制備和質量鑒定

一、實驗目的

采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法從植物組織中提取基因組DNA，并進行DNA純度分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測。第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理

核酸是生物有機體的重要成分，在細胞中核酸常與蛋白質結合在一起，以核蛋白形式存在。在制備核酸時，通過研磨破壞細胞壁和細胞膜，使核蛋白被釋放出來。在濃NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很??；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的NaCl溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低濃度鹽溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高濃度鹽溶液中CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。分離得到核蛋白后，可用氯仿等將蛋白等雜質除去。第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月有效制備大分子DNA的兩個原則：1）防止和抑制內源DNase對DNA的降解。2）盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。

第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實驗材料：植物葉片約0.2克四、實驗試劑

1MTris-HCl(pH8.0)(提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞)

CTAB分離緩沖液：2%CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，0.2%巰基乙醇(EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解，存在于液相中；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易從基因組DNA中除去)

洗滌緩沖液：76%乙醇，10mmol/L乙酸銨氯仿-異戊醇(24:1)、異丙醇、TE緩沖液液氮第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實驗步驟CTAB分離緩沖液置于60℃水浴中預熱；2人一組，摘取0.5g葉片，置于研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎；取約0.2g葉片粉末加入到2.0mL離心管中，加入1ml預熱的CTAB分離緩沖液，輕輕轉動使之混勻；樣品置于65℃保溫30min；加等體積(1mL)的氯仿-異戊醇，輕輕顛倒混勻；室溫下14000rpm離心10min；第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月上層水相吸入另一干凈1.5mL離心管中，加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置5min，使核酸沉淀下來；室溫下10000rpm離心10min；棄去上清液，加入500μL洗滌緩沖液，懸浮混勻；4℃條件下，14000rpm離心10min；在室溫下使DNA沉淀干燥至周圍透明，中間有少許白色為止；將DNA沉淀溶于20μLTE中，-20℃保存?zhèn)溆茫蝗?uLDNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，檢查所提取DNA的完整性；利用核酸蛋白檢測儀進行DNA濃度和純度檢測。

（方法同實驗二）第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月六、實驗結果

基因組DNA的濃度和純度；觀察并分析電泳圖片七、實驗報告按實驗內容完成實驗報告及教材上的思考題。第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗四PCR反應一、實驗目的

了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技術。第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理PCR技術是通過模擬體內DNA復制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴增出來的技術。

PCR的過程：高溫變性：將反應體系置于高溫下變性，使模板雙鏈DNA解鏈為兩條單鏈。低溫退火：引物與模板鏈結合，形成部分雙鏈DNA。中溫延伸：TaqDNA聚合酶使引物從5′端向3′端延伸，4種dNTP摻入合成新的DNA互補鏈。

反復進行這種變性、退火和聚合反應循環(huán)，可使兩端引物限定范圍內的DNA序列以指數(shù)形式擴增。第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實驗材料

質粒：pEGFP

四、試劑1.10×PCRbuffer、rTaq酶2.dNTPmixtures：dATP,dTTP,dGTP,dCTP各2.5mM引物(2.5μM)GFP-F:5'-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-5'

(Tm=65.5℃)

GFP-R:5'-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'

(Tm=61.5℃)4.2.0%瓊脂糖凝膠第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實驗步驟1、PCR反應混合液的配制(50μl)

10×PCRbuffer5μldNTPmixture4μl

前向引物(P1)8μl

反向引物(P2)8μlDNA模板0.5μlrTaq酶0.5μl

滅菌蒸餾水24μl

所有試劑按量仔細添加后，輕輕混勻，稍離心后即可，為了防止反應混合液蒸發(fā)，可添加30μl礦物油覆蓋。

第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2、PCR儀的參數(shù)設置

94℃4min94℃30sec

40cycles61℃30sec72℃50sec72℃5min3、瓊脂糖凝膠電泳檢測

反應結束后，取5μlPCR產品，加入1μl6×loadingbuffer，混勻后點樣，電泳20min。

其余45μlPCR產品保存在-20℃冰箱中，下次實驗使用。第29頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月六、實驗結果觀察并分析電泳圖片七、實驗報告按實驗內容完成實驗報告及教材上的思考題。第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗五PCR產品純化及克隆一、實驗目的

學習PCR產物純化的實驗技術，掌握基因工程操作技術中最常用的T-A克隆方法。第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理

PCR產物一般都含有過量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影響后續(xù)的DNA連接酶的連接反應;實驗中可采用苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿依次使反應體系中的蛋白質雜質變性的方法純化DNA產品，然后在酸性條件下用無水乙醇沉淀DNA。利用普通的TaqDNA聚合酶所擴增的PCR產物的3’-端具有一個A突出末端，T載體的5’-端具有一個T突出末端，二者正好互補，然后用T4DNA連接酶在體外將目的片段與線性化載體連接的方法稱為T-A克隆。

第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實驗材料

實驗四的PCR產品

pMD19-TVector四、試劑TE緩沖液苯酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)、氯仿醋酸鈉（pH5.2）、無水乙醇、70%乙醇T4DNA連接酶混合物(SolutionI)第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實驗步驟1、PCR產品純化將PCR產品（約45μl）小心轉入1.5ml離心管中，加入55μlTE緩沖液至總體積100μl，混勻；加入100μl苯酚/氯仿/異戊醇，渦旋混合1min，14000rpm離心5min；將上層水相轉移至新離心管，加入100μl氯仿，渦旋混合1min，14000rpm離心5min；再將上層水相轉移至新離心管，加10μl醋酸鈉（pH=5.2）和250μl無水乙醇，顛倒混勻，將離心管插入冰中放置30min；第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月在4℃，14000rpm離心10min，棄去上清液，觀察DNA沉淀；加入500μl預冷70％乙醇，洗滌DNA沉淀,4℃14000rpm離心5min，棄去上清液；空氣干燥DNA沉淀，加5μl無菌水溶解

DNA。2、連接反應經純化的PCR產品4.5μl轉移到PCR管中，加入0.5μlpMD19-T載體，再加入5μlT4DNA連接酶混合物（SolutionI），輕輕混勻，稍加離心即可；連接反應混合物放置在PCR儀中，16℃連接過夜；連接產物用于下次轉化實驗。第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月六、實驗結果

本次實驗結果必須等到下次實驗完成后才能確定是否連接成功。七、實驗報告

按實驗內容完成實驗報告及教材上的思考題。（下周不用交報告，實驗六完成后再交）第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗六感受態(tài)細胞的制備和轉化一、實驗目的了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。學習用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法。學習外源DNA轉化大腸桿菌受體細胞的方法。第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理

轉化是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株(R-，M-)，這些變異株可以容忍外源DNA分子進入體內并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細胞經過一些化學試劑如CaCl2、RbCl等處理后，細胞膜的通透性會發(fā)生暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。進入受體細胞的DNA分子通過復制，表達實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、實驗材料

E.coliDH5α菌株：R-，M-，Amp-

實驗五的連接產物：pMD19/GFP四、試劑

1、含氨芐青霉素(Amp,100mg/L)的LB固體培養(yǎng)基

2、X-gal儲存液（20mg/ml）

3、IPTG儲存液（200mg/ml）

4、0.10mol/LCaCl2溶液第40頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實驗步驟1、受體菌的培養(yǎng)

從LB平板上挑取新鮮活化的E.coliDH5α單菌落，接種于3-5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3h至OD600=0.5左右。

(實驗老師已幫大家完成)第41頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2、感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)吸取1.5mL培養(yǎng)液到一滅菌的離心管中，將離心管插入冰中放置10min，然后于4℃下10000rpm離心10min。棄去上清，用1mL預冷的0.10mol/LCaCl2

溶液輕輕懸浮細胞，將離心管插入冰中放置30min，4℃下10000rpm離心10min。棄去上清，加入100μl預冷的0.10mol/LCaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰中放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞。第42頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月3、連接產物的轉化

向制備的感受態(tài)細胞中加入10μl連接產物，輕輕搖勻，插入冰中，放置30min。含有混合物的離心管置入42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速插入冰中，冷卻3-5min。向離心管中加入900μLLB液體培養(yǎng)基，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1~2h，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。第43頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月4、轉化產物的涂布篩選培養(yǎng)基