基因工程的基本操作程序完美課課件

基因工程的基本操作程序公開課2、能否用SARS病毒作為基因載體？3、作為載體，若沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？4、攜帶目的基因的載體是否進(jìn)入了受體細(xì)胞，如何鑒定？5、假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制，將怎樣？1、從化學(xué)組成來(lái)看，載體應(yīng)含有什么成分？雙鏈DNA不能目的基因不能插入載體上應(yīng)有標(biāo)記基因可能造成基因丟失分子搬運(yùn)工——載體四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因人胰島素基因目的基因插入點(diǎn)目的基因DNA連接酶目的基因插入點(diǎn)目的基因人胰島素基因目的基因含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基死亡死亡存活存活死亡存活1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、從基因文庫(kù)中獲?。ㄐ蛄形粗?、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（序列已知）基因文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)－－如：cDNA文庫(kù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一、目的基因的獲取3、人工合成(基因比較小，序列已知)反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA（化學(xué)合成）依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性從基因文庫(kù)中獲取目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。

②原理：__________多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)人工合成法（基因較小，核苷酸序列已知）mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）

1.目的A.使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代B.同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用2.基因表達(dá)載體的組成：a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程（1）用_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)切口露出____________。（2）用___________切割目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將目的基因插入質(zhì)粒的______處，加入___________，形成了一個(gè)重組DNA分子限制酶黏性末端同種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同（2）用___________切割目RNA－DNA雜合雙鏈大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA在受熱下，_____斷裂，形成________方法——抗原-抗體雜交二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因基因在染色體上的位置（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(2)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA（化學(xué)合成）含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA（化學(xué)合成）在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。方法——抗原-抗體雜交含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基方法——抗原-抗體雜交三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

------轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程穩(wěn)定表達(dá)受體細(xì)胞方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn):a.能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無(wú)感染能力b.Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌整合植物細(xì)胞染色體DNA表達(dá)新性狀外源基因?qū)胫参锛?xì)胞（2）基因槍法特點(diǎn)：成本高適用于單子葉植物（3）花粉通道法我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）方法：Ca2+處理法（增加細(xì)胞膜通透性）（2）微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少（3）過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)（分子水平）:是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:個(gè)體生物學(xué)水平鑒定（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因A方法:DNA分子雜交B過(guò)程:1.檢測(cè)編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？編碼區(qū)是間隔的、_____的含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子（2）微生物作受體細(xì)胞原因：②過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA?；瘜W(xué)合成法、反轉(zhuǎn)錄法c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)？含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞5、假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制，將怎樣？含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（序列已知）表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（序列已知）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)

基因探針通過(guò)分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交帶，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來(lái)。

(2)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①方法:分子雜交法②過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法:抗原-抗體雜交提取方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)2.鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等目的基因的表達(dá)和檢測(cè)抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等抗原－抗體雜交法DNA-RNA分子雜交法DNA分子雜交法受體是否具有轉(zhuǎn)基因特征個(gè)體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的染色體分子水平方法檢測(cè)對(duì)象非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子原核真核原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動(dòng)子終止子基因不含非編碼系列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子模板DNA能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無(wú)感染能力(基因比較小，序列已知)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)？（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（序列已知）大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因1、從基因文庫(kù)中獲取（序列未知）（1）用_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)切口露出____________。5、假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制，將怎樣？④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____2基因工程的基本操作程序含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)b、復(fù)性（55℃-65℃）：溫度降低，引物與單鏈DNA結(jié)合，形成局部________。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束③過(guò)程：a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA在受熱下，_____斷裂，形成________b、復(fù)性（55℃-65℃）：溫度降低，引物與單鏈DNA結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____⑤條件：前提條件:________________⑥結(jié)果：指數(shù)2n短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因已知基因的核苷酸序列DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所解旋方式酶PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較高溫解旋酶體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶（3）人工合成法：

在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成化學(xué)合成法、反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA（化學(xué)合成）2、能否用SARS病毒作為基因載體？將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。（2）微生物作受體細(xì)胞原因：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）方法：Ca2+處理法（增加細(xì)胞膜通透性）如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)？①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)(基因比較小，序列已知)①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（序列已知）基因探針通過(guò)分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交帶，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來(lái)。目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因（2）微生物作受體細(xì)胞原因：含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基RNA－DNA雜合雙鏈蛋白質(zhì)mRNADNA推測(cè)推測(cè)DNADNA合成儀合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：生物某個(gè)發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組DNA與載體連接cDNA文庫(kù)反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存②cDNA文庫(kù)的構(gòu)建-----逆轉(zhuǎn)錄法：

目的基因所在片段運(yùn)載體PStⅠDNA連接酶重組DNA運(yùn)載體自連目的基因自連CTTAAGCTTAAGCTTAACTTAAGGPStⅠ運(yùn)載體的特點(diǎn)3：

有標(biāo)記基因

導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因證明：不存活含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基證明：大腸桿菌含抗四環(huán)素基因證明：

大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因

四環(huán)素抗性基因

四環(huán)素抗性基因完全培養(yǎng)基存活如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)？導(dǎo)入接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因證明：不存活含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基證明：大腸桿菌含抗四環(huán)素基因證明：

大腸桿菌的受體細(xì)胞含有目的基因

四環(huán)素抗性基因

四環(huán)素抗性基因完全培養(yǎng)基存活如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)？基因文庫(kù)

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。（便于在不知道目的基因核苷酸序列的情況下，獲得所需的目的基因。）某種生物的全部DNA限制酶DNA片段DNA片段與載體連接重組DNA基因組文庫(kù)導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存①基因組文庫(kù)的構(gòu)建導(dǎo)入接種培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基死亡如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)？接種培養(yǎng)含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基死亡目的基因?qū)虢臃N培養(yǎng)含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基存活如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)？接種培養(yǎng)含有氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基存活運(yùn)載體自連繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少（1）用_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)切口露出____________。②過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子