大鼠脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化能力的影響實驗研究

第第頁大鼠脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化能力的影響實驗研究了解ADSCs的體外生長規(guī)律、生物學(xué)特性及成骨誘導(dǎo)分化能力的各種參數(shù)，已經(jīng)成為目前急需解決的問題。本研究通過探討ADSCs的生長增殖活性以及成骨分化能力，為ADSCs是否可以成為理想的種子細(xì)胞以及進(jìn)一步基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗對象健康SD大鼠，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2方法

1.2.1ADSCs分離及原代、傳代培養(yǎng)

取SD大鼠，無菌條件下取腹股溝部脂肪組織，常規(guī)方法沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，置37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)每3d換液。待細(xì)胞生長達(dá)到80%時，進(jìn)行1∶2傳代，繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

1.2.2貼壁細(xì)胞鑒定

取第2代的ADSCs，按照試劑盒說明進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，分為4份，分別滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49d、CD106一抗。用SABC顯色試劑盒顯色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及指標(biāo)檢測

取第3代細(xì)胞，分別以1×104/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板、5×104/mL的密度接種到放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，更換為含有0.1μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μmol/L抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)劑的DMEM培養(yǎng)基，每3d換液。以加入不含誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基的3代細(xì)胞作為對照組。

1.3.1形態(tài)學(xué)觀察

每日在顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的生長情況以及形態(tài)特點(diǎn)。

1.3.2茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)計數(shù)

取成骨誘導(dǎo)21d的細(xì)胞，0.1%茜素紅染色30min，鏡下觀察照相。將每孔均分為4個象限，每個象限隨機(jī)取一低倍2個視野，取8視野計數(shù)均值。

2結(jié)果

2.1貼壁細(xì)胞鑒定

對第2代貼壁細(xì)胞通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測了CD34、CD44、CD49d、CD106四個細(xì)胞表面標(biāo)記，結(jié)果顯示貼壁細(xì)胞CD44、CD49d陽性表達(dá)，細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色；而CD34、CD106為陰性表達(dá)，大部分細(xì)胞胞漿未著色，細(xì)胞核藍(lán)染。說明貼壁細(xì)胞為ADSCs，而非造血干細(xì)胞和BMSCs。

2.2成骨能力檢測結(jié)果

2.2.1形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)后，生長速度明顯變慢，細(xì)胞形態(tài)變化相似，逐漸由梭形變?yōu)榱⒎叫巍⑷切?、多角形，有?shù)個突起。

2.2.2礦化結(jié)節(jié)染色

成骨誘導(dǎo)21d，細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色出現(xiàn)紅色結(jié)節(jié)的陽性染色（圖1），不加誘導(dǎo)劑的對照組染色為陰性（圖2）。

3討論

本實驗中從脂肪組織獲取的單個核細(xì)胞，經(jīng)過貼壁培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞表面表達(dá)CD44、CD49d陽性；而CD34、CD106為陰性表達(dá)。CD34作為造血干細(xì)胞標(biāo)志性免疫表型，CD34陰性說明貼壁細(xì)胞并非來源于血液循環(huán)中的干細(xì)胞[1]，同時說明細(xì)胞未受到脂肪組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染；有研究顯示ADSCs與BMSCs都可表達(dá)CD44[2]；CD49d在ADSCs中為陽性表達(dá)，在BMSCs中則為陰性表達(dá)；而與CD106則相反；本實驗CD106陰性表達(dá)，已經(jīng)排除BMSCs污染的可能。以上結(jié)論說明已經(jīng)得到純度較高的ADSCs。CD49d是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞定居歸巢到骨髓的表面分子，CD106是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞從骨髓中向外遷移的表面分子，CD49d與CD106是ADSCs與BMSCs很好的區(qū)別標(biāo)記[3]，但其本質(zhì)有待進(jìn)一步的研究。

礦化結(jié)節(jié)是體外培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞鑒定的一個重要指標(biāo)，也是直接反應(yīng)干細(xì)胞成骨分化能力的一項指標(biāo)。ADSCs誘導(dǎo)21d后經(jīng)茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色，均出現(xiàn)紅色結(jié)節(jié)的陽性表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1]CivinCI，BanquerigoML，StraussLC，etal.Antigenicanalysisofhematopoiesis.VI.FlowcytometriccharacterizationofMy-10-positiveprogenitorcellsinnormalhumanbonemarrow.ExpHematol，1987，15（1）：10-17.

[2]KatzAJ，TholpadyA，TholpadySS，etal.Cellsurfaceandtranscriptionalcharacterizationofhumanadipose-derivedadherentstromal（hADAS）cells.StemCells，2005，23（3）：412-423.

[3]GronthosS，F(xiàn)ranklinDM，LeddyHA，etal.Surf